72568 - BIOCHIMICA DELLA SEGNALAZIONE CELLULARE CON LABORATORIO

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite dei principali meccanismi biochimici di segnalazione intracellulare e dell'interazione funzionale tra organelli. Acquisisce inoltre esperienza pratica delle principali tecniche di coltivazione di cellule in vitro e delle metodologie per studiare la vitalità/morte cellulare e l' efficienza energetica, sia in popolazioni cellulari che analizzando le funzioni cellulari in singola cellula in vivo mediante sonde fluorescenti. In particolare, lo studente è in grado di: - analizzare e discutere con padronanza argomenti di biochimica cellulare; - individuare le metodologie più efficaci per risolvere problemi biologici specifici; - effettuare analisi accurate per identificare alterazioni delle funzioni energetiche cellulari.

Contenuti

Classici  secondi messaggeri intracellulari (AMP ciclico e Calcio) e metodologie innovative per la loro misura.

Misure in vivo degli aspetti spazio-temporali della segnalazione da ciclico AMP: PKA ricombinate e FRET. Microdomini di cAMP in vivo; proteine AKAP.   

Concetto di "calcium-signalling toolkit". Struttura dei recettori per IP3 e rianodinico. I messaggeri intracellulari cADPR e NAADP: biosintesi e funzione. Aspetti temporali e  spaziali della segnalazione di calcio: onde, oscillazioni e meccanismi ipotizzati.  Entrata capacitativa di calcio nella membrana plasmatica: ruolo delle proteine Stim e Orai. Calcio e mitocondri: una relazione molto stretta...

Mitocondri: non solo produttori di energia, ma crocevia strategico di segnalazione intracellulare. Organizzazione sopramolecolare della catena respiratoria: complessi e supercomplessi:  come si isolano, si studiano e perche' sono importanti.  Il genoma mitocondriale: caratteristiche, organizzazione dei nucleoidi, mutazioni,  malattie mitocondriali e neurodegenerazioni.  Metaboliti mitocondriali come  segnali tumorigenici od oncometaboliti: ruolo nell'attivazione e inattivazione del fattore di trascrizione HIF-1alfa; mutazioni nella succinato e isocitrato deidrogenasi. Alterazioni molecolari della via glicolitica responsabili dell'effetto Warburg.  Mutazioni del genoma mitocondriale e cancro: dall'effetto Warburg alla "trasformazione metabolica" nei tumori.

Ultrastruttura dei mitocondri mediante analisi tomografica, crio-microscopia elettronica e microscopia a super-risoluzione: le cristae junctions e loro  implicazioni funzionali.

Morfologia dei mitocondri. Analisi morfologica e funzionale del reticolo mitocondriale; studi in vivo mediante sonde e proteine fluorescenti ricombinanti. 

Le proteine che determinano la forma del reticolo mitocondriale e la sua dinamica: Drp1, mitofusine e OPA1: struttura, funzione e regolazione; relazione tra proteina delle dinamica ed apoptosi. Isoforme di OPA1 e mtDNA.

Interazioni mitocondri e altri organelli intracellulari.

Mitocondri e reticolo endoplasmico:  ruolo nell'omeostasi del calcio. Microdomini di calcio ER-mitocondri e proteine coinvolte: ruolo controverso della mitofusina-2. Calcio mitocondriale e regolazione del metabolismo energetico e dell'apoptosi.

Meccanismi di controllo-qualità  nei diversi compartimenti mitocondriale: PINK-1 e localizzazione mitocondriale; interazione con Parkina; optineurina e LC3; dinamica mitocondriale e autofagia.

Lisosomi:  non solo la pattumiera della cellula...

 

Nel laboratorio sperimentale ogni studente segue una serie di lezioni teoriche riguardanti le tecniche utilizzate nella parte sperimentale. Esegue  quindi una serie di esperimenti in cui impara a manipolare cellule animali in coltura. Successivamente utilizza alcune linee cellulari per evidenziare disfunzioni di proteine mitocondriali. 

Gli esprimenti consistono in: 1. Tripsinizzazione, conta e semina di cellule adese; 2. Misura del consumo di glucosio e produzione di lattato in cellule con disfunzioni mitocondriali; 3. Analisi della morfologia del reticolo mitocondriale in cellule fissate mediante microscopia a fluorescenza e quantificazione;  4. Semina di cellule nei multiwell per la determinazione della vitalità  cellulare dopo stress metabolico mediante saggio colorimetrico.

Testi/Bibliografia

Il docente fornità le indicazioni bibliografiche (rassegne e lavori originali). I files PDF con il materiale illustrato durante le lezioni saranno a disposizione degli studenti, previa iscrizione alla lista di distribuzione del docente e accesso al sito AMS Campus, utilizzando la password fornita dal docente.

Metodi didattici

Durante le lezioni verranno discusse alcune importanti problematiche della segnalazione cellulare. Il corso teorico è affiancato da un laboratorio sperimentale, in cui ciascun studente potrà effettuare una serie di esperimenti semplici, imparando le metodologie di base per lo studio delle funzioni cellulari, quali spettrofotometria, microscopia ottica e a fluorescenza, elettroforesi, etc. Imparerà inoltre le procedure fondamentali per manipolare e propagare cellule in coltura.  Queste attività saranno programmate in modo che lo studente possa realizzare praticamente le soluzioni dei alcuni problemi delineati in forma teorica durante le lezioni.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

La prova di verifica dell'apprendimento é orale e prevede una serie di domande, che tenderanno ad accertare la conoscenza da parte dello studente degli argomenti svolti a lezione.

Per quanto riguarda la verifica dell'apprendimento della parte riguardante il laboratorio sperimentale, si effettuerà un test scritto, che  consiste in 5 quesiti, che fanno riferimento alle metodologie e alle procedure eseguite nelle esperienze di laboratorio.

Strumenti a supporto della didattica

presentazioni ppt; lavori scientifici

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Michela Rugolo