84937 - METODI CHIMICO-MOLECOLARI PER LO STUDIO DELLE PROTEINE

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite di metodi utilizzati per la produzione e la purificazione di proteine e metallo-proteine, sia da fonti biologiche che utilizzando tecniche di DNA ricombinante. Inoltre, apprende i principi fisici e le applicazioni di alcune tecniche calorimetriche, spettroscopiche e di diffusione della luce volte alla caratterizzazione della conformazione e dello stato oligomerico delle proteine e metallo-proteine in soluzione, allo studio dei loro cambiamenti conformazionali, e all'analisi delle interazioni che intervengono durante il loro funzionamento. In particolare, lo studente è in grado di i) proporre le strategie sperimentali per l’espressione e l’isolamento di proteine di interesse nella loro forma nativa, ii) comprendere l'uso di tecniche spettroscopiche per analizzare la struttura secondaria e terziaria e i cambiamenti conformazionali, iii) comprendere l'uso di tecniche di diffusione della luce per definire lo stato oligomerico delle proteine tramite la determinazione delle loro proprietà idrodinamiche, iv) comprendere l'uso della calorimetria per definire lo stato conformazionale delle proteine e le interazioni proteina-proteina e proteina-ligando, inclusi ioni metallici. Durante le attività pratiche di laboratorio lo studente svolge un protocollo di espressione e purificazione di una metallo-proteina ricombinante e utilizza programmi di analisi di dati di calorimetria e diffusione della luce su proteine e metallo-proteine.

Contenuti

Introduzione (2 ore) - Introduzione allo studio delle proteine e ai metodi per isolarle dalla fonte biologica o in forma ricombinante.

Produzione di proteine (4 ore) - Metodi di clonaggio per proteine ricombinanti. Uso di E. coli come ospite di espressione. Ottimizzazione dell'espressione di una proteina in E. coli. Promotori inducibili. Stabilità della proteina. Corpi di inclusione. Come aumentare la solubilità̀ di una proteina: secrezione nel periplasma, uso di chaperones, coespressione. Uso di “tags” e proteine di fusione. Come ottimizzare le condizioni di crescita di E. coli per aumentare la resa in proteina ricombinante. Espressione di proteine ricombinanti in cellule eucariotiche: lievito, insetto, mammifero, pianta. Sistemi di espressione “cell-free”.

Purificazione di proteine (4 ore) - Tecniche cromatografiche per la separazione di proteine. Salting in/out. Controllo qualità delle proteine purificate: stabilità e misura della concentrazione e della purezza delle proteine ottenute.

Stabilità strutturale delle proteine (12 ore) - Dicroismo circolare di proteine. “Protein-folding”: considerazioni termodinamiche e cinetiche. Forze che guidano il ripiegamento proteico. Teoria dell'imbuto conformazionale. Studio della stabilità strutturale attraverso la perturbazione della sruttura proteica. Denaturazione chimica e termica seguita da dicroismo circolare, fluorimetria a scansione differenziale e calorimetria a scansione differenziale. Proteine intrinsecamente disordinate. Studiare le proteine nel loro ambiente cellulare: in cell NMR.

Interazioni molecolari (10 ore) - “Isothermal titration calorimetry”. Teoria e applicazioni. “Scattering” della luce per studiare la struttura quaternaria delle proteine. Termoforesi di microscala.

Applicazioni della biofisica di proteine (8 ore) - Metodologie di ricerca applicata in centri o aziende private, con particolare attenzione ai parametri che le differenziano dalla ricerca di base. Le lezioni saranno tenute in presenza di docenti provenienti da ambiti di ricerca internazionale.

Simulazione di un'esperienza di laboratorio di purificazione di proteine (2 ore) - attraverso software specifici simuleremo le attività da svolgere per la simulazione di una proteina.

Come trattare i dati sperimentali (6 ore) -Mediante software specifici analizzeremo dati di dicroismo circolare, calorimetria, fluorimetria a scansione differenziale, per comprendere come gestire, in pratica, i dati sperimentali

Testi/Bibliografia

Materiale e articoli scienfici saranno forniti dal docente.

Metodi didattici

Le lezioni saranno di tipo frontale. Le lezioni con i docenti internazionali si svolgeranno anche su piattaforma Teams o Zoom. Saranno svolte alcune lezioni pratiche per spiegare come analizzare i dati sperimentali, utilizzando software accessibili online.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

L'esame di fine corso mira a valutare il raggiungimento degli obiettivi didattici e in particolare a verificare che lo studente abbia conoscenze teoriche e pratiche sulle metodologie per i) produrre proteine ricombinanti e isolarle, ii) studiare le loro proprietà biochimico-strutturali e idrodinamiche, iii) valutare i cambiamenti conformazionali in seguito a perturbazione della struttura e iv) definire le interazioni biomolecolari.

L'esame potrà svolgersi secondo due modalità, a scelta dello studente:

1) Modalità “interattiva”: allo studente è richiesto di venire a lezione, partecipare alle attività in aula e rielaborare a casa le informazioni acquisite. Questa modalità è dedicata agli studenti che vogliono seguire e partecipare alle lezioni e studiare gli argomenti man mano questi vengono proposti, così da ritrovarsi pronti a concludere l'esame al primo appello. Il voto sarà determinato dalla somma dei punteggi ottenuti per queste attività. La lode si otterrà con 32 o 33 punti totali.

- Presentazione sull’approfondimento di un argomento a scelta:8  

- Portfolio (da compilare, a cura dello studente, alla fine di ogni argomento): 12

- Prova di contenuto (domande a risposta multipla): 12

- Partecipazione al forum: 1

2) Modalità “classica”, di tipo scritto. Consiste in 3 domande aperte su altrettanti argomenti dell'insegnamento. La relazione di laboratorio (che deve fare chi non compila il portfolio) determinerà  come verrà arrotondato (per eccesso o per difetto) il voto finale.

Strumenti a supporto della didattica

Materiale didattico: il materiale didattico presentato a lezione e gli articoli su cui studiare verranno messi a disposizione degli studenti in formato elettronico tramite la piattaforma Moodle.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Barbara Zambelli