69348 - METODI CHIMICO-MOLECOLARI PER LO STUDIO DELLE PROTEINE

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite di alcuni metodi largamente utilizzati per l'identificazione, la produzione e la purificazione di proteine. Inoltre, apprende i principi fisici e le applicazioni di alcune tecniche calorimetriche, spettroscopiche e di scattering della luce volte alla caratterizzazione della conformazione e dello stato oligomerico delle proteine in soluzione, allo studio dei loro cambiamenti conformazionali, e all'analisi delle interazioni che intervengono durante il loro funzionamento. In particolare, lo studente è in grado di: - proporre le strategie sperimentali per isolare le proteine nella loro forma nativa; - comprendere l'uso di tecniche per analizzare la loro struttura secondaria e terziaria e i cambiamenti conformazionali; - comprendere l'uso di tecniche per definire le proprietà idrodinamiche delle proteine in soluzione, quali il loro peso molecolare e lo stato oligomerico; - comprendere l'uso della calorimetria per definire lo stato conformazionale delle proteine e le interazioni proteina-proteina e proteina-ligando; - utilizzare alcuni programmi di analisi dei dati sperimentali.

Contenuti

Produzione di proteine. Proteine ricombinanti. Espressione di proteine in batteri. Vettori di espressione e proteine di fusione. Uso dei codoni e codice genetico. Aumentare la stabilità e la resa proteica. Screening dell'espressione high throughput. Espressione di proteine in cellule eucariotiche: insetto, lievito, mammifero, piante, "cell-free".

Purificazione di proteine. Le tre fasi della purificazione di proteine. Tecniche di separazione. Salting in/out. Cromatografia liquida. Cromatografia di affinità, scambio ionico, interazione idrofobica, esclusione molecolare. Disegnare un protocollo di purificazione. Testare la purezza di una proteina.

Stabilità strutturale delle proteine. Fattori che influenzano la stabilità delle proteine in soluzione. Valutare la temperatura di denaturazione. Studio di struttura secondaria e terziaria di proteine. Dicroismo circolare e interpretazione degli spettri. Thermo-shift assay. Calorimetria a scansione differenziale. Insiemi conformazionali. Paradigma struttura-funzione e proteine intrinsecamente disordinate.

Interazioni molecolari. Studio delle interazioni proteina-proteina, proteina-ligando e proteina-DNA. Basi teoriche e pratiche della “Isothermal titration calorimetry”. La calorimetria per lo studio della cinetica enzimatica. Studio di struttura quaternaria e proprietà idrodinamiche attraverso scattering della luce statico e dinamico. Come trattare e interpretare i dati sperimentali con l'utilizzo di software specifici.

Testi/Bibliografia

Non è necessario acquistare testi specifici. Materiale e articoli scienfici saranno forniti dal docente attraverso un sistema di condivisione dei files (Dropbox o AMS Campus).

Metodi didattici

Le lezioni saranno articolate in 4 CFU (32 ore) prevalentemente di tipo frontale. Il corso prevede quattro ore di esercitazioni pratiche al computer, in cui ogni studente verrà dotato di una postazione per gli esercizi, volte all'apprendimento dei programmi specifici per l'analisi dati calorimetrici e spettroscopici. Questa parte verrà svolta presso il Laboratorio di Bioinformatica (Navile).

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

L'esame di fine corso mira a valutare il raggiungimento degli obiettivi didattici e in particolare a verificare che lo studente abbia conoscenze teoriche e pratiche sulle metodologie per i) produrre proteine ricombinanti e isolarle, ii) studiare le loro proprietà biochimico-strutturali e idrodinamiche, iii) valutare i cambiamenti conformazionali in seguito a perturbazione della struttura e iv) definire le interazioni bimolecolari. Allo studente verrà chiesto di scegliere un argomento, tra quelli trattati nel corso, su cui dovrà svolgere una breve ricerca bibliografica, che verrà poi illustrata oralmente in sede d'esame. Inoltre, durante l'esame, allo studente sarà chiesto di rispondere a una/due domande inerenti i principali obiettivi del piano formativo. Il voto verrà determinato come media tra il risultato della ricerca effettuata e la capacità dello studente di rispondere ai quesiti proposti.

Strumenti a supporto della didattica

Materiale didattico: il materiale didattico presentato a lezione verrà messo a disposizione degli studenti in formato elettronico tramite internet.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Barbara Zambelli