65821 - BIOLOGIA VEGETALE MOLECOLARE

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite dei moderni sviluppi in alcuni ambiti specifici della fisiologia vegetale e delle principali metodologie finalizzate all'espressione di proteine ricombinanti vegetali e alla loro caratterizzazione. In particolare, lo studente è in grado di: - analizzare e discutere con padronanza argomenti di genomica, biologia redox, fisiologia degli stress abiotici e biotici delle piante superiori; - valutare in modo critico la letteratura scientifica relativa agli argomenti trattati; - analizzare frammenti di DNA e trasformare cellule batteriche; - purificare proteine ricombinanti mediante tecniche cromatografiche; - condurre analisi biochimiche e molecolari di caratterizzazione del prodotto proteico.

Contenuti

Il corso è comprende lezioni frontali per 4 CFU (Prof. Trost) e un laboratorio sperimentale individuale di 3 CFU (Dott.ssa Sparla).

Programma delle lezioni frontali:

Arabidopsis thaliana come specie modello in biologia vegetale. Genoma nucleare e del plastidio. Trasferimento genico endosimbiontico. Importo e smistamento delle proteine nei plastidi.

Stess ossidativo e redox signalling.Produzione e detossificazione di ROS nelle piante. Fotosintesi e fotoinibizione. Mitocondri. NADPH-ossidasi. Segnalazione redox basata sulle cisteine.

Stress abiotici. Stress idrico: aggiustamento osmotico e acido abscissico.

Stress biotici. Classi di fitopatogeni e patogenesi. Difese costitutive delle piante. Immunità basale e resistenza verticale (ipotesi guardia e modello gene per gene). Scoppio ossidativo, monossido d'azoto e risposta ipersensibile. Risposte sistemiche.

Programma del laboratorio:

1° giorno: estrazione di DNA plasmidico ed analisi mediante endonuclesi di restrizione.
Calcoli e discussione.

2°giorno: trasformazione di cellule di E. coli BL21(DE3) e selezione dei trasformanti su terreno con kanamicina.
NBT-staining per verificare la produzione di ROS in risposta a ferita in foglie di A. thaliana.

3° giorno: rilancio in coltura liquida di una colonia cresciuta su piastra.
Separazione in SDS-page e successivo Western blot di proteine vegetali.

4° giorno: induzione dell'espressione della proteina ricombinante mediante IPTG; curva di crescita batterica.
Incubazione con anticorpo secondario coniugato alla fosfatasi alcalina e rilevazione colorimetrica.
Calcoli e discussione.

5° giorno: lisi cellulare e purificazione della proteina ricombianante mediante cromatografia ad interazione metallica; desalting del campione proteico.

6° giorno: valutazione mediante gel elettroforesi denaturante del grado di purificazione della proteina ricombinante; misurazione della concentrazione proteica.
Calcoli e discussione.

7 giorno: misurazione dell'attività cinetica dell'enzima ricombinante e analisi di trasferimento bi-elettronico.
Calcoli e discussione.

8° giorno: spettri d'assorbimento della proteina ricombinante; valutazione della natura del cofattore flavinico.
Calcoli e conclusioni finali.

Testi/Bibliografia

Rascio et al., Elementi di fisiologia vegetale, EdiSes Napoli 2012

Taiz, Zeiger, Plant physiology, quinta edizione, Sinauer Associates

Buchanan, Gruissem, Jones, Biochimica e Biologia molecolare delle piante, Zanichelli

Reviews aggiornatesugli argomenti principali (fornite dal docente)

Lezioni power point (per la parte teorica)

Protocollo dettagliato dell'intero laboratorio

Metodi didattici

Parte teorica: lezioni frontali
Parte di laboratorio: Ogni studente è tenuto a svolgere l'attività sperimentale di laboratorio in modo individuale. Il docente svolgerà una parte teorica di introduzione al laboratorio e continua assistenza tecnica. Discussione comune finale dei risultati ottenuti.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

Alla fine del laboratorio gli studenti dovranno superare un test scritto.
L'esame finale è orale e la valutazione comprende il risultato del test di laboratorio.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Paolo Bernardo Trost

Consulta il sito web di Francesca Sparla