65737 - BIOCHIMICA CELLULARE MOLECOLARE

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite dei principali meccanismi biochimici di segnalazione intracellulare e dell'interazione funzionale tra organelli. Acquisisce inoltre esperienza pratica delle tecniche di coltivazione di cellule in vitro, delle metodologie per determinare la vitalità/morte cellulare e per analizzare le funzioni cellulari in singola cellula in vivo mediante sonde fluorescenti. In particolare, lo studente è in grado di: - analizzare e discutere con padronanza argomenti di biochimica cellulare; - definire le metodologie da utilizzare per risolvere problemi biologici specifici.

Contenuti

Rivisitazione deimitocondri. Il genoma mitocondriale e le malattie mitocondriali. Ruolo delle mutazioni del genoma mitocondriale nella tumorigenesi: implicazione del fattore di trascrizioneHIF-1alfa. Effetto Warburg e nuove acquisizionisulla "trasformazione metabolica" nei tumori.Caratteristiche ultrastrutturali dei mitocondrie implicazioni funzionali. Eterogeneitàmorfologica e funzionale del reticolo mitocondriale; studi in vivo mediante sonde e proteine fluorescenti ricombinanti.Le proteine della dinamica del reticolo mitocondriale:Drp1,mitofusine e OPA1: struttura e regolazione.PINK e Parkina. Ruolo nell'apoptosi e autofagia.

I secondi messaggeri: AMP ciclico, struttura e isoforme delle adenilato ciclasi e fosfodiesterasi. Misure di AMP ciclico in vivo mediante proteine ricombinanti fluorescenti. PKA, EPAC e AKAP.

Concetto di "calcium-signalling toolkit"; trasportatori e canali delle membrane cellulari; Struttura dei recettori per IP3 e rianodinico. I messaggeri intracellulari cADPR e NAADP: biosintesi e funzione.Aspetti temporali e spaziali della segnalazione di calcio: onde, oscillazioni e meccanismi ipotizzati. Entrata capacitativa di calcio nella membrana plasmatica: ruolo delleproteine Stim e Orai. Calcio nei mitocondri: uniporto e scambiatori; misure di calcio nella matrice mediante mt-aequorina; dimostrazione dell'esistenza di microdomini di calcio ER-mitocondri. Proteine coinvolte nelle relazioni ER-mitocondri. Calcio mitocondriale e metabolismo cellulare.

I recettori a 7 eliche transmembrana: caratteristiche e classificazione; strategie di segnalazione indipendenti da proteine G. Inattivazione recettoriale: le GRK ele beta-arrestine.Recettori chimerici di classe A e B: segnalazione, traffico intracellulare e attivazione delle MAP chinasi. Trans-attivazione dei recettori tirosina chinasici,crosstalk con recettori insulina e IGF1-R..

Nel laboratorio sperimentale ogni studente eseguirà una serie diesperimenti in cui imparerà le metodologie di base per identificare e caratterizzare disfunzioni mitocondriali, utilizzando cellule in coltura.Gli esprimenti consistono in:1. Tripsinizzazione, conta e semina di cellule adese; 2. Determinazione del contenuto proteico; 3.Misura della velocità della glicolisi anaerobica;4. Analisi della morfologia e del potenziale mitocondriale in vivo mediante microscopia a fluorescenza in singola cellula:5.Valutazione della produzione di specie reattive dell'ossigeno in cellule intatte; 6. Determinazione della vitalità cellulare dopo stress metabolico;7. Identificazione di una mutazione del mtDNA in cellule umane: estrazione del DNA genomico, amplificazione del mtDNA, digestionee separazione mediante elettroforesi su gel di agarosio.

Testi/Bibliografia

Rassegne ed articoli su riviste scientifiche

Metodi didattici

Lezioni frontali

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

La prova di verifica dell'apprendimento é orale e prevede una serie di domande, che tenderanno ad accertare la conoscenza da parte dello studente degli argomenti svolti a lezione.

Per quanto riguarda la verifica dell'apprendimento della parte riguardante il laboratorio sperimentale, si effettuerà un test scritto, che consiste in 5 quesiti, che fanno riferimento alle metodologie e alle procedure eseguite nelle esperienze di laboratorio.

Strumenti a supporto della didattica

Videoproiettore, PC, presentazioni powerpoint, articoli scientifici.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Michela Rugolo