00062 - BIOCHIMICA APPLICATA

Conoscenze e abilità da conseguire

L' insegnamento si propone di fornire conoscenze sulle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi delle biomolecole.

Contenuti

Principii della ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica: animali, estratti di organi e tessuti, liquidi fisiologici, colture cellulari. Soluzioni-tampone e pH: scelta dei tamponi per uso biochimico. Amminoacidi e punto isoelettrico.

Omogenizzazione: scelta delle metodiche e dei media.

Tecniche centrifugative: principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione. Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari; flottazione differenziale di lipoproteine. Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni: separazione di cellule, organelli subcellulari, proteine, acidi nucleici. Valutazione della resa e dell'arricchimento: “marcatori” subcellulari.

Metodi basati sulla solubilità delle proteine: precipitazione frazionata con solfato d'ammonio e isoelettrica; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore.

Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni

Estrazione

Tecniche cromatografiche: Principii generali: risoluzione e piatti teorici. Cromatografia su colonna.

Cromatografia di adsorbimento e ripartizione. Cenni sulla TLC: cromatografia bidimensionale. Cromatografia idrofobica di proteine (HIC).

Cromatografia a scambio ionico di proteine. Analizzatore automatico di amminoacidi.

Cromatografia ad esclusione (gel filtrazione).

Cromatografia di affinità. Immunoaffinità. Cromatografia con coloranti e con lectine. Cromatografia con metalli; purificazione di proteine “etichettate” con istidina. Purificazione di proteine ricombinanti.

HPLC e FPLC. Determinazione della sequenza di proteine.

Tecniche elettroforetiche: principii generali: fattori che influenzano la mobilità elettroforetica. Elettroforesi in fase libera. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine sieriche. Elettroforesi su gel: PAGE e PAGE-SDS. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.

Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale. Applicazioni nella proteomica. Elettroforesi capillare. Blotting. Western blotting e immunorivelazione.

Tecniche analitiche

Tecniche spettroscopiche

Spettrofotometria UV-VIS in Biochimica. Relazione di Lambert-Beer. Dosaggi colorimetrici: metodi di determinazione delle proteine.

Spettrofluorimetria: principii generali e applicazioni in Biochimica. Fluorofori intrinseci ed estrinseci. Studi su struttura e funzione di proteine e membrane. FRET.

Microspettrofluorimetria; FRAP; citofluorimetria a flusso e “cell sorting”.

Cenni alla Luminometria. Cenni sull'uso della spettrometria di massa in Proteomica.

Tecniche enzimatiche: Cinetica enzimatica: velocità iniziale. Effetto sulla velocità delle concentrazioni di enzima e substrato. Parametri cinetici. Inibizione reversibile ed irreversibile.

Metodi di dosaggio continui, discontinui, accoppiati. Dosaggi spettrofotometrici, fluorimetrici, radioisotopici, immunochimici. Dosaggi di enzimi di interesse clinico. Isoenzimi. Dosaggi enzimatici di metaboliti: “a termine” e cinetici. Purificazione di enzimi: attività specifica e resa. Enzimi immobilizzati.

Tecniche radioisotopiche: Emissioni radioattive: velocità ed energia del decadimento. Unità di misura; attività specifica. Metodi di conteggio basati sulla eccitazione: contatori a scintillazione solida e liquida. “Quenching” e valutazione dell'efficienza. Statistica nel conteggio. Preparazione dei campioni. Autoradiografia. Studi di legame (grafico di Scatchard). Applicazioni in Biochimica.

Tecniche immunochimiche: richiami su anticorpi e loro preparazione, antigeni e apteni. Immunoprecipitazione in fase libera. Immunoelettroforesi. Immunoblotting. Dosaggi radioimmunologici (RIA, IRMA) ed immunoenzimatici ( ELISA): applicazioni in biochimica sperimentale e in diagnostica.

Tecniche elettrochimiche:  Elettrodo ad ossigeno e respirazione mitocondriale. Biosensori.

Tecniche di Biologia Molecolare: Analisi del DNA: elettroforesi, Southern blotting, sequenza del DNA secondo Sanger. Uso di enzimi di restrizione nello studio di malattie genetiche: identificazione di RFLP. Interazione DNA-proteine di legame (foot-printing). Curve di "melting" e di rinaturazione del DNA.

Analisi dell'RNA: purificazione tramite cromatografia di affinità. Northern Blotting. RNA microassays.

Di ogni tecnica vengono discussi aspetti strumentali ed applicativi con relativi esempi.

 

Testi/Bibliografia

K.Wilson e J.Walker -  Biochimica  e Biologia Molecolare: Principi e tecniche - Cortina Editore, 2006

 

Metodi didattici

Durante le lezioni verranno presentate le metodiche  connesse con la sperimentazione biochimica  negli aspetti sia strumentali sia applicativi. Per ogni tecnica verranno discussi esempi pratici.  Il corso sará affiancato da brevi esercitazioni di laboratorio e informatiche.

Durante il Corso verranno poi presentati e discussi questionari e problemi.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

La prova di accertamento é orale e tenderà ad accertare la conoscenza teorica da parte dello studente delle metodologie analizzate nonché la capacità di applicare tali metodiche a problemi biochimici pratici.  

 

Strumenti a supporto della didattica

Videoproiettore, PC, Lavagna luminosa.

Utilizzo di un laboratorio biologico polivalente.

Le diapositive aggiornate delle lezioni sono disponibili, in formato pdf, al seguente indirizzo: http://campus.cib.unibo.it.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Gabriele Hakim