Abstract
Il Disordine da Deficit di CDKL5 (CDD) è una grave encefalopatia dello sviluppo, causata da mutazioni nel gene CDKL5, fondamentale per il corretto sviluppo cerebrale nelle prime fasi della vita. I pazienti affetti presentano crisi epilettiche precoci, ritardo psicomotorio e deficit cognitivi e motori. Attualmente non esistono terapie efficaci per il trattamento di questa condizione. Recenti studi preclinici condotti dall’unità dell’Università di Bologna (UNIBO) hanno dimostrato che una terapia proteica sostitutiva basata sulla somministrazione di una proteina CDKL5 purificata ai topi knockout per Cdkl5 è in grado di migliorare significativamente i sintomi della malattia. Questi risultati aprono la strada allo sviluppo di una terapia innovativa per il CDD. Tuttavia, la produzione di una proteina CDKL5 a lunghezza intera e in forma attiva rappresenta ancora una sfida biotecnologica. La proteina appartiene infatti alla categoria delle proteine che contengono regioni intrinsecamente disordinate (IDR), che, pur rappresentando circa il 30% del proteoma umano, sono difficili da studiare, produrre e purificare a causa della loro instabilità strutturale. In particolare, CDKL5 presenta un dominio catalitico N-terminale bilobato (~300 residui) e da una lunga IDR C-terminale (~700 residui), che tende ad aggregarsi e presenta una bassa resa in condizioni standard. In un promettente studio pilota, l’unità dell’Università di Napoli (UNINA) ha dimostrato che il batterio antartico Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 costituisce un sistema di espressione alternativo efficace, capace di produrre una forma solubile e funzionale di CDKL5. Questo microrganismo si configura quindi come una piattaforma ideale per la produzione su larga scala della proteina. Il presente progetto mira a potenziare la produzione della proteina CDKL5 e a migliorarne l’efficacia terapeutica attraverso tre obiettivi principali: 1. Ottimizzare l’espressione, la purificazione e la formulazione della CDKL5 prodotta da P. haloplanktis TAC125; 2. Valutare l’incapsulamento della proteina in nanocarrier biocompatibili per un rilascio mirato e controllato; 3. Testare in vivo l’efficacia terapeutica della CDKL5 così prodotta e purificata nei modelli murini della patologia. I risultati attesi avranno un impatto immediato sulla comunità CDD, e nel lungo termine, offriranno nuove soluzioni anche per la produzione di altre proteine terapeutiche con IDR, finora poco accessibili a causa di difficoltà tecniche.
Risultati raggiunti
Il progetto ha coinvolto l’Università degli Studi di Napoli Federico II e l’Università di Bologna e ha esplorato una strada innovativa: utilizzare il batterio antartico Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125 come “fabbrica biologica” per produrre la proteina umana CDKL5. Questa scelta nasce dalla capacità di questo microrganismo di sintetizzare proteine complesse in condizioni particolarmente favorevoli. Uno dei risultati più significativi del progetto riguarda proprio l’ottimizzazione della produzione della proteina CDKL5. I ricercatori hanno migliorato il processo produttivo intervenendo sia sulle condizioni di crescita del batterio sia sulle tecniche di purificazione della proteina. È stato inoltre sviluppato un nuovo test analitico altamente sensibile che consente di misurare con precisione la quantità di proteina CDKL5 integra prodotta. Questi avanzamenti hanno portato a un aumento della resa, della purezza e della qualità del prodotto ottenuto, creando una piattaforma tecnologica solida per studi futuri. Un altro importante traguardo è stato il controllo approfondito della qualità della proteina ricombinante. Attraverso analisi biochimiche avanzate e tecniche di spettrometria di massa, il team ha dimostrato che la proteina prodotta mantiene la propria attività enzimatica e presenta caratteristiche strutturali compatibili con un possibile impiego terapeutico. Queste informazioni rappresentano un passaggio fondamentale verso lo sviluppo di future applicazioni cliniche. Parallelamente, il progetto ha consentito di creare e validare modelli cellulari particolarmente affidabili della malattia. I ricercatori dell’Università di Bologna hanno caratterizzato neuroni derivati da modelli animali privi del gene CDKL5, dimostrando che riproducono fedelmente le alterazioni osservate nei pazienti. Questi modelli costituiscono oggi uno strumento prezioso per valutare nuove strategie terapeutiche e per comprendere meglio i meccanismi della malattia. Le attività sperimentali hanno però evidenziato anche una sfida scientifica importante: la proteina CDKL5 purificata tende ad aggregarsi quando viene trasferita in condizioni biologiche compatibili con le cellule. Questo fenomeno ha limitato la possibilità di dimostrare, entro la durata del progetto, l’efficacia della somministrazione diretta della proteina nei modelli cellulari e animali. Sebbene questo obiettivo non sia stato completamente raggiunto, il lavoro svolto ha permesso di identificare con precisione i principali ostacoli tecnici da superare e di definire nuove strategie per affrontarli. Per superare queste criticità, il progetto ha inoltre esplorato l’utilizzo di nanocarrier, ovvero sistemi di trasporto basati su nanoparticelle e liposomi capaci di proteggere le proteine terapeutiche e facilitarne il rilascio nei tessuti. Gli studi di fattibilità hanno dimostrato che queste tecnologie sono promettenti per il trasporto di molecole biologiche complesse e rappresentano una base concreta per future applicazioni dedicate alla proteina CDKL5. Oltre ai risultati scientifici, ERT4CDD ha avuto un forte impatto sulla formazione di giovani ricercatori e sulla diffusione della conoscenza. I risultati del progetto sono stati presentati in numerosi congressi internazionali, inclusi gli incontri della comunità scientifica e delle famiglie coinvolte nella CDD, e hanno dato origine a pubblicazioni scientifiche attualmente in fase di revisione. L’importanza e il potenziale delle conoscenze generate sono stati confermati dall’avvio del nuovo progetto ILLUMINA, finanziato dalla Regione Campania e nato direttamente dai risultati ottenuti da ERT4CDD. Questo consentirà di proseguire il percorso di ricerca verso la produzione di una proteina CDKL5 sempre più stabile, sicura ed efficace. In conclusione, ERT4CDD ha raggiunto risultati di grande valore scientifico e tecnologico. Pur non avendo ancora portato a una terapia pronta per l’uso clinico, il progetto ha costruito le fondamenta necessarie per lo sviluppo di future strategie terapeutiche innovative contro la Sindrome da Deficit di CDKL5, contribuendo ad avvicinare la ricerca a soluzioni concrete per i pazienti e le loro famiglie.Dettagli del progetto
Responsabile scientifico: Stefania Trazzi
Strutture Unibo coinvolte:
Dipartimento di Scienze Biomediche e Neuromotorie
Coordinatore:
Università degli Studi di NAPOLI Federico II(Italy)
Contributo totale Unibo: Euro (EUR) 50.000,00
Durata del progetto in mesi: 24
Data di inizio
12/10/2023
Data di fine:
28/02/2026
