84937 - METODI CHIMICO-MOLECOLARI PER LO STUDIO DELLE PROTEINE

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite di metodi utilizzati per la produzione e la purificazione di proteine e metallo-proteine, sia da fonti biologiche che utilizzando tecniche di DNA ricombinante. Inoltre, apprende i principi fisici e le applicazioni di alcune tecniche calorimetriche, spettroscopiche e di diffusione della luce volte alla caratterizzazione della conformazione e dello stato oligomerico delle proteine e metallo-proteine in soluzione, allo studio dei loro cambiamenti conformazionali, e all'analisi delle interazioni che intervengono durante il loro funzionamento. In particolare, lo studente è in grado di i) proporre le strategie sperimentali per l’espressione e l’isolamento di proteine di interesse nella loro forma nativa, ii) comprendere l'uso di tecniche spettroscopiche per analizzare la struttura secondaria e terziaria e i cambiamenti conformazionali, iii) comprendere l'uso di tecniche di diffusione della luce per definire lo stato oligomerico delle proteine tramite la determinazione delle loro proprietà idrodinamiche, iv) comprendere l'uso della calorimetria per definire lo stato conformazionale delle proteine e le interazioni proteina-proteina e proteina-ligando, inclusi ioni metallici. Durante le attività pratiche di laboratorio lo studente svolge un protocollo di espressione e purificazione di una metallo-proteina ricombinante e utilizza programmi di analisi di dati di calorimetria e diffusione della luce su proteine e metallo-proteine.

Contenuti

Introduzione - Introduzione allo studio delle proteine e ai metodi per isolarle dalla fonte biologica o in forma ricombinante.

Produzione di proteine - Metodi di clonaggio per proteine ricombinanti. Uso di E. coli come ospite di espressione. Ottimizzazione dell'espressione di una proteina in E. coli. Promotori inducibili. Stabilità della proteina. Corpi di inclusione. Come aumentare la solubilità̀ di una proteina: secrezione nel periplasma, uso di chaperones, coespressione. Uso di “tags” e proteine di fusione. Come ottimizzare le condizioni di crescita di E. coli per aumentare la resa in proteina ricombinante. Espressione di proteine ricombinanti in cellule eucariotiche: lievito, insetto, mammifero, pianta. Sistemi di espressione “cell-free”.

Purificazione di proteine - Tecniche cromatografiche per la separazione di proteine. Salting in/out. Controllo qualità delle proteine purificate: stabilità e misura della concentrazione e della purezza delle proteine ottenute.

Stabilità strutturale delle proteine - Dicroismo circolare di proteine. “Protein-folding”: considerazioni termodinamiche e cinetiche. Forze che guidano il ripiegamento proteico. Teoria dell'imbuto conformazionale. Studio della stabilità strutturale attraverso la perturbazione della sruttura proteica. Denaturazione chimica e termica seguita da dicroismo circolare, fluorimetria a scansione differenziale e calorimetria a scansione differenziale. Proteine intrinsecamente disordinate.

Interazioni molecolari - “Isothermal titration calorimetry”. Teoria e applicazioni. “Scattering” della luce per studiare la struttura quaternaria delle proteine. Termoforesi di microscala. Uso di software per analizzare i dati di titolazione di una proteina con ioni metallici e dell'attività̀ di un metallo-enzima con "isothermal titration calorimetry". Interpretazione quantitativa degli spettri di dicroismo circolare.

Esperienza di laboratorio - Espressione eterologa di una proteina in E. coli, purificazione attraverso tecniche cromatografiche, verifica della purezza con SDS-PAGE, caratterizzazione biofisica.

Testi/Bibliografia

Materiale e articoli scienfici saranno forniti dal docente.

Metodi didattici

Le lezioni saranno articolate in 4 CFU (32 ore) di tipo frontale. Il corso prevede quattro ore di esercitazioni pratiche al computer, in cui ogni studente verrà dotato di una postazione per gli esercizi, volte all'apprendimento dei programmi specifici per l'analisi dati calorimetrici e spettroscopici. Questa parte verrà svolta presso il Laboratorio di Bioinformatica (Navile). Il laboratorio di 2 CFU (30 ore) sarà svolto presso il plesso Belmeloro.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

L'esame di fine corso mira a valutare il raggiungimento degli obiettivi didattici e in particolare a verificare che lo studente abbia conoscenze teoriche e pratiche sulle metodologie per i) produrre proteine ricombinanti e isolarle, ii) studiare le loro proprietà biochimico-strutturali e idrodinamiche, iii) valutare i cambiamenti conformazionali in seguito a perturbazione della struttura e iv) definire le interazioni biomolecolari. Allo studente, o a un gruppo di studenti, verrà chiesto di scegliere un argomento, tra quelli trattati nel corso, su cui dovrà svolgere una breve ricerca bibliografica, che verrà poi illustrata in una breve presentazione o in una relazione scritta. Una relazione scritta sarà redatta dagli studenti anche per l’esperienza di laboratorio. Durante l'esame, che sarà in forma scritta, allo studente sarà chiesto di rispondere a una/due domande inerente i principali obiettivi del piano formativo. Il voto verrà determinato come media tra il risultato della ricerca ed esposizione effettuata, sia per la ricerca che per la relazione di laboratorio, e la capacità dello studente di rispondere ai quesiti proposti.

Strumenti a supporto della didattica

Materiale didattico: il materiale didattico presentato a lezione verrà messo a disposizione degli studenti in formato elettronico tramite internet.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Barbara Zambelli