37628 - LABORATORIO DI FILOGENESI MOLECOLARE

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze avanzate sulle principali tecniche di laboratorio per lo studio della filogenesi molecolare ai diversi livelli tassonomici. In particolare, lo studente è in grado di utilizzare le seguenti tecniche: isolamento di DNA totale, elettroforesi, amplificazione in PCR, clonaggio batterico, utilizzo di endonucleasi di restrizione, sequenziamento, analisi di marcatori molecolari di interesse filogenetico.

Contenuti

Definizione di tassonomia, sistematica e filogenesi. Caratteri tassonomici, omologia, analogia. La filogenesi su base molecolare: vantaggi e svantaggi.

Principi di evoluzione molecolare. Mutazione: classificazione delle mutazioni, mutazioni puntiformi, mutazioni segmentali. Standing genetic variation: diversità genica, diversità nucleotidica, variazioni strutturali. Cambiamenti nelle frequenze alleliche: selezione (co-dominanza, dominanza e recessività, overdominance e underdominance); deriva genetica; dimensione effettiva della popolazione; teoria della coalescenza. Sostituzione genica/allelica: probabilità di fissazione; tempo di fissazione; tasso di sostituzione genica; mutational meltdown; mutazioni quai neutrali. Teorema di Fisher e fitness landscape. Linkage disequilibrium: effetto autostop e selective sweep, hard sweeps e soft sweeps, background selection. Epistasi. La distribuzione degli effetti delle mutazioni sulla fitness.

Pattern di evoluzione molecolare. Tassi di sostituzione nucleotidica in geni codificanti e in regioni non codificanti. Cause della variazione nei tassi di sostituzione: constraints funzionali, tassi sinonimi e non sinonimi, variazioni tra diverse regioni dei geni, variazione tra geni, rilassamento della selezione, patterns di sostituzione amminoacidica. Utilizzo non casuale di codoni sinonimi (codon bias), efficienza traduzionale ed accuratezza traduzionale. Cause della variabilità dei tassi di sostituzione fra diverse linee evolutive: DNA repair hypothesis, generation-time hypothesis, metabolic rate hypothesis, varying-selection hypothesis; fossili viventi.

Scelta dei marcatori e omoplasia nei dati molecolari. Dalla teoria della coalescenza alla filogenesi: il problema "albero delle specie e albero dei geni". Ruolo del Next Generation Sequencing per lo studio della filogenesi (filogenomica).

Metodi per lo studio dei dati molecolari. Allineamento delle sequenze codificanti e non codificanti (allineamenti progressivi e approcci con iterazioni); allineamenti strutturali. Dati concatenati; matrici filogenomiche. Divergenza genetica osservata. Sostituzioni multiple e modelli di sostituzione nucleotidici e amino acidici. Eterogeneità delle sostituzioni tra i siti e proporzione di siti invarianti.
Ricostruzioni filogenetiche: approccio algoritmico (distance-based - UPGMA, Neighbor-Joining) e metodi di ricerca del miglior albero (character-based). Criteri di ottimizzazione: alberi di Maximum Parsimony e Maximum Likelihood. Supporto dei nodi: tecniche di ricampionamento (Bootstrap; Jackknife) e tecniche basate sui caratteri (Bremer support). Inferenza Bayesiana e probabiltà a posteriori. Ricerca tramite il metodo Markov chain Monte Carlo (MCMC). Orologio molecolare stretto, rilassato e locale. Cronogrammi e calibrazione degli alberi tramite reperti fossili, eventi biogeografici e calibrazioni secondarie. Validazioni, sensitivity analysis e problemi nell'inferenza filogenetica: nucleotide compositional bias, signal saturation, long branch attraction, incomplete lineage sorting.

Generalità sulle tecniche in preparazione al laboratorio biologico.

Laboratorio biologico a posto singolo: Isolamento di DNA totale, amplificazione in PCR , clonaggio (ligation della sequenza di interesse in vettore plasmidico, trasformazione di cellule competenti), verifica in PCR dei cloni positivi; sequenziamento.

Laboratorio informatico a posto singolo: Analisi ed editing dei cromatogrammi di sequenze di DNA; banca dati Genbank, ricerca con Blast; allineamento multiplo di sequenze di DNA (ClustalW; Muscle); calcolo delle distanze genetiche e scelta del modello di sostituzione; ricostruzione filogenetica: Neighbor-Joining, Maximum parsimony, Maximum Likelihood e inferenza Bayesiana. Supporto nodale con metodo di bootstrap. Calibrazione e calcolo di cronogrammi con metodi bayesiani.

Testi/Bibliografia

Si consigliano i seguenti testi:
Dan Graur. Molecular and Genome Evolution. 2016, Sinauer Associates.
Naruya Saitou. Introduction to Evolutionary Genomics. 2013, Springer.
Philippe Lemey (ed.) . Phylogenetic Handbook. 2009, Cambridge University Press.
Barry G. Hall. Phylogenetic Trees Made Easy: A How-To Manual. 2011, Sinauer Associates.

Inoltre sarà eventualmente fornito materiale dal docente.

Metodi didattici

presentazioni .ppt; lavoro a posto singolo in laboratori didattici di biologia molecolare ed informatico

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

La prova d'esame mira a verificare il raggiungimento dei seguenti obiettivi didattici:

conoscenza approfondita di teorie e processi di evoluzione molecolare e del loro studio

conoscenza approfondita delle tecniche di laboratorio per lo studio di marcatori molecolari utili ai fini filogenetici a diversi livelli tassonomici

conoscenza approfondita dei metodi di analisi per l'elaborazione di dati per lo studio della filogenesi molecolare

capacità di interpretare dati di filogenesi

La prova d'esame prevede un test scritto sugli argomenti inerenti i principali obiettivi del Corso e una prova orale dove verranno approfonditi argomenti specifici.

Per sostenere la prova d'esame è necessaria l'iscrizione su Almaesami, nel rispetto inderogabile delle scadenze previste. Coloro che non riuscissero ad iscriversi entro la data prevista, sono tenuti a comunicare tempestivamente (e comunque prima della chiusura ufficiale delle liste di iscrizione) il problema alla segreteria didattica. Sarà facoltà del docente ammetterli a sostenere la prova.

La verbalizzazione della valutazione conseguita avviene entro 5 giorni dalla prova e può avvenire in assenza dello studente come da Linee Guida presenti al sito http://www.unibo.it/Portale/Guida/AlmaEsamiInformazioniDocenti.htm .

Strumenti a supporto della didattica

presentazioni .ppt; laboratorio di biologia molecolare; laboratorio informatico

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Andrea Luchetti

Consulta il sito web di Fausto Tinti

Consulta il sito web di Fabrizio Ghiselli