00062 - BIOCHIMICA APPLICATA

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso lo studente - acquisisce le conoscenze di base delle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi di biomolecole; - è in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.

Contenuti

Modulo1 di Biochimica Applicata- (3 CFU) - Dott.ssa Cecilia Prata

Introduzione. Principii della ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica. Cenni di Microscopia.

Colture cellulari

Campioni biologici

Soluzioni-tampone e pH: scelta dei tamponi per uso biochimico. Amminoacidi e punto isoelettrico.

Omogenizzazione: scelta delle metodiche e dei media.

Tecniche centrifugative: principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione. Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari; flottazione differenziale di lipoproteine. Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni: separazione di cellule, organelli subcellulari, proteine, acidi nucleici. Valutazione della resa e dell'arricchimento: “marcatori” subcellulari

Precipitazione frazionata di proteine: precipitazione frazionata con solfato d'ammonio e isoelettrica; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore.

Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni.

Estrazione (cenni)

Tecniche cromatografiche: principii generali, risoluzione e piatti teorici. Cromatografia su colonna.

Cromatografia di adsorbimento e ripartizione. Cenni sulla TLC: cromatografia bidimensionale. Cromatografia idrofobica di proteine (HIC).

Cromatografia a scambio ionico di proteine. Analizzatore automatico di amminoacidi.

Cromatografia ad esclusione (gel filtrazione).

Cromatografia di affinità. Immunoaffinità. Cromatografia con coloranti e con lectine. Cromatografia con metalli; purificazione di proteine “etichettate” con istidina. Purificazione di proteine ricombinanti.

Modulo 2 di Biochimica Applicata -(5 CFU)- Prof.ssa Romana Fato

HPLC.

Purificazione di enzimi: attività specifica e resa. Enzimi immobilizzati.

Determinazione della sequenza di proteine (sequenziamento di Edman e mediante spettrometria di massa).

Tecniche elettroforetiche: principii generali, fattori che influenzano la mobilità elettroforetica. Elettroforesi in fase libera. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine seriche. Elettroforesi su gel: PAGE, PAGE-SDS, Agarosio. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative. Blotting - Western blotting nello studio delle proteine: applicazioni biochimiche e diagnostiche.

Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale.

Tecniche spettroscopiche

Spettrofotometria UV-VIS in Biochimica. Relazione di Lambert-Beer. Dosaggi colorimetrici.

Tecniche enzimatiche. Richiami di cinetica enzimatica: velocità iniziale, effetto della concentrazione di enzima e substrato, pH e temperatura. Inibizione irreversibile e reversibile. Inibitori competitivi, non competitivi, acompetitivi. Modificazione chimica di proteine, inibitori come farmaci. Dosaggio dell'attività enzimatica: metodi continui, discontinui, diretti, indiretti e accoppiati.

Valutazione di enzimi e metaboliti plasmatici/serici a scopo diagnostico. Tipologie delle analisi biochimico cliniche di laboratorio. Il prelievo di sangue . Enzimi presenti nei materiali biologici, loro dosaggio e significato clinico della valutazione dell'attività. Caratteristiche generali, ruolo biochimico e metodi di dosaggio dei principali enzimi di interesse clinico: LDH, CPK, AST e ALT, fosfatasi alcalina, colinesterasi. Profili enzimatici: cardiaco, epatico e pancreatico. Metaboliti di interesse clinico: glucosio (glicemia, test di tolleranza al glucosio, emoglobina glicata), colesterolo e dislipidemie. Proteine plasmatiche: natura, funzione, significato della determinazione quantitativa e importanza diagnostica. Lipoproteine plasmatiche: significato della determinazione quantitativa e importanza diagnostica.

Di ogni tecnica vengono discussi aspetti strumentali ed applicativi con relativi esempi.

Spettrofluorimetria ( principi generali e applicazioni) e Chemiluminescenza- Citofluorimetria a flusso e “cell sorting”. Cenni di Luminometria.

Tecniche elettrochimiche . Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori.

Metodi radioisotopici. Principi, strumentazione ed applicazioni. Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività. Efficienza di conteggio e quenching. Autoradiografia. Applicazioni dei radioisotopi in biochimica: studio di vie metaboliche, studio di sistemi di trasporto e assorbimento, studi di legame. Applicazione dei radioisotopi nell'analisi clinica.

Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi di analisi: reazione di immunoprecipitazione in fase libera ed in gel, immunodiffusione; metodi radioimmunologici: RIA ed IRMA; dosaggi immunoenzimatici: EMIT, ELISA e PEIA. Dosaggi ormonali: metodiche e applicazioni. Diagnosi di laboratorio della gravidanza: dosaggio della gonadotropina corionica umana.

Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche, forensiche e paleobiologiche. Sequenze VNTR: test di paternità. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche. Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica.  Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray. Cenni sulla proteomica.

Testi/Bibliografia

K.Wilson e J.Walker -  Biochimica  e Biologia Molecolare: Principi e tecniche - Cortina Editore, 2006

Metodi didattici

Durante le lezioni verranno presentate le metodiche  connesse con la sperimentazione biochimica  negli aspetti sia strumentali sia applicativi. Per ogni tecnica verranno discussi esempi pratici.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

L'esame consiste in un colloquio orale su entrambi i moduli didattici, che non possono essere sostenuti in momenti di verifica separati fra loro.
L'esame di fine corso mira a verificare e valutare il raggiungimento degli obiettivi didattici:
- conoscere i principi di base delle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi di biomolecole;
- essere in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.
La durata della prova orale è mediamente di 30-45 minuti.
Il voto finale del Corso di Biochimica Applicata (Moduli I e II) viene definito, mediante una prova orale articolata su tre principali quesiti che verteranno su argomenti inerenti gli obiettivi del Corso. La valutazione della preparazione del candidato potrà avvalersi di ulteriori domande volte a specificare aspetti relativi ai tre quesiti principali.
Sarà oggetto di valutazione la capacità dello studente di sapersi muovere all'interno delle varie tecniche e applicazioni biochimiche. Il raggiungimento da parte dello studente di una visione organica dei temi affrontati a lezione congiunta alla loro utilizzazione critica, la dimostrazione del possesso di una padronanza espressiva e di linguaggio specifico saranno valutati con voti di eccellenza.

Strumenti a supporto della didattica

Videoproiettore, PC, Lavagna luminosa

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Romana Fato

Consulta il sito web di Cecilia Prata