00062 - BIOCHIMICA APPLICATA

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso lo studente:- conosce e comprende i principi e le applicazioni delle metodologie di indagine biochimica, sia nell’ambito del laboratorio di ricerca che nell’ambito della biochimica clinica, ai fini della separazione, identificazione, caratterizzazione e analisi delle biomolecole, dei meccanismi delle attività metaboliche dei fenomeni biologici, anche in rapporto all’azione dei farmaci e dei dispositivi diagnostici per analisi biologiche.- è in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.I 2 CFU di esercitazioni uniti ai 2 CFU di laboratorio permetteranno allo studente di acquisire competenze teorico/pratiche di alcune metodologie applicate nella sperimentazione biochimica e biochimica clinica con particolare attenzione per la logica dell'impostazione degli esperimenti e della raccolta dati.

Contenuti

Modulo1 di Biochimica Applicata- (3 CFU) - Prof.ssa Cecilia Prata

Introduzione - Principii della ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica. Biosensori

Cenni di Microscopia

Colture cellulari: strumentazione di base di un laboratorio di colture cellulari (cappe a flusso laminare, incubatori). Colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura e tecniche di coltura.

Fluidi biologici e Anticorpi: Sangue, Plasma, Siero, Urine e altri fluidi biologici. Enzimi immobilizzati e biosensori.

Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi per dosare anticorpi (es. Test sierologici) e anticorpi per dosare antigeni (es. Test gravidanza) cenni a tecniche immuno enzimatiche (ELISA).

Preparazione di campioni da cellule o da tessuti biologici: Scelta del tampone. Omogeneizzazione (scelta delle metodiche e dei media).

Tecniche centrifugative (principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione). Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari; flottazione differenziale di lipoproteine. Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni: separazione di cellule, organelli subcellulari, proteine, acidi nucleici. Valutazione della resa e dell'arricchimento: “marcatori” subcellulari.

Metodiche di purificazione delle proteine: precipitazione frazionata di proteine con solfato d'ammonio e isoelettrica; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore. Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni.

Tecniche cromatografiche

Principii generali, risoluzione e piatti teorici. Cromatografia su colonna.

Cromatografia idrofobica di proteine (HIC).

Cromatografia liquida ad alta pressione: HPLC. Principali componenti di un sistema HPLC; scelta delle fasi stazionaria e mobile in funzione dell'analisi da eseguire. Principali detectors associati ad un sistema HPLC.

Gas Cromatografia

Tecniche di spettroscopia UV-Vis

Richiami di spettroscopia UV-Vis, legge di Lambert Beer, strumentazione, cromofori.

Dosaggi colorimetrici: metodi per la determinazione del contenuto proteico di un campione biologico.

Tecniche spettrofluorimetriche

Richiami di spettrofluorimetria, resa quantica, decadimento di fluorescenza, strumentazione, cromofori intrinseci ed estrinseci. strumentazione.

Uso delle tecniche fluorimetriche nell'analisi qualitativa e quantitativa (linearità della relazione tra l'intensità di fluorescenza e la concentrazione della soluzione, effetto di filtro interno).

Fosforescenza e chemiluminescenza: principi di base ed applicazioni pratiche.

Applicazioni biologiche delle tecniche fluorimetriche: localizzazione di fluorofori e studio di dinamiche di interazione molecolare sfruttando il fenomeno del quenching di fluorescenza (collisionale o dinamico e statico) costante di Stern-Volmer e determinazione del coefficiente di diffusione di un fluoroforo in soluzione.

Trasferimento di energia per risonanza (FRET) : efficienza del trasferimento di energia, esempi di applicazione: studi di oligomerizzazione delle proteine, interazione proteina-acidi nucleici e proteina lipidi.

Fluorescenza in luce polarizzata: determinazione di anisotropia statica e dinamica: principi di base ed applicazioni allo studio delle proteine

Principi di base del light-scattering e suo utilizzo per lo studio delle dimensioni di particelle (citofluorimetro).

Modulo 2 di Biochimica Applicata -(2 CFU_esercitazioni in aula)- Prof.ssa Laura Giusti

 

Tecniche elettroforetiche

Principii generali, fattori che influenzano la mobilità elettroforetica

Elettroforesi su gel: Agarosio, PAGE, PAGE-SDS. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.

Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.

Elettroforesi capillare

Blotting - Western blotting nello studio delle proteine: applicazioni biochimiche e diagnostiche.

ELISA : diretto, indiretto, sandwich diretto e indiretto, competitivo. RIA

Cenni ad altre tecniche immunochimiche: immunodiffusione, immunoelettroforesi, immunoprecipitazione

Applicazioni della spettrometria di massa allo studio di macromolecole biologiche.

Principi di base della spettroscopia di Massa: sorgente di ioni (Maldi, ESI), analizzatore di massa (TOF, analizzatore a quadrupolo).

Esempi di applicazione della massa per lo studio/identificazione di un polipeptide. Peptide mass fingerprinting.

Uso della spettroscopia di massa per la determinazione delle modificazioni indotte sulle proteine: grado di fosforilazione, alchilazione/acetilazione di residui aminoacidici, studio dell'interazione con farmaci ecc.

Determinazione della sequenza di proteine (sequenziamento di Edman e mediante spettrometria di massa).

Cenni sulle applicazioni della proteomica.

Metodi di purificazione di enzimi

Scelta della tecnica di purificazione più adatta al campione in esame.

Determinazione dell'attività specifica e valutazione della resa.

Dosaggi enzimatici.

Richiami di cinetica enzimatica, ipotesi dello stato stazionario ed equazione di Michaelis-Menten.

Determinazione sperimentale della velocità delle reazioni catalizzate da enzimi: Dosaggio dell'attività enzimatica: metodi continui, discontinui, diretti, indiretti e accoppiati.

Studio dell'inibizione enzimatica: inibitori competitivi, non competitivi e misti. Grafico di Lineweaver-Burk , determinazione della Ki.

Enzimi immobilizzati.

Tecniche di biologia molecolare

Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali.

Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche, forensiche e paleobiologiche.

Sequenze VNTR: test di paternità. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche.

Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica.

Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray.

Modulo 3- di Biochimica Applicata (2CFU_Laboratorio) Prof.ssa Laura Giusti

Il laboratorio si svolgerà in due turni:

Turno A/Turno B

Al termine del laboratorio didattico di Biochimica Applicata, lo studente avrà applicato e appreso alcune delle tecniche biochimiche affrontate durante le lezioni frontali: lavorare con le colture cellulari, estrarre e separare proteine da un campione cellulare, determinare la concentrazione e l’attività di un enzima.

Il laboratorio sarà strutturato in esercitazioni differenti, interconnesse fra di loro, associate ad alcune ore di spiegazione dei principi delle tecniche che saranno utilizzate durante le esperienze.

• COLTURE CELLULARI

Apprendimento delle tecniche di base per il mantenimento e la messa in coltura di linee cellulari neuronali stabili come modelli in vitro per lo studio di effetti biochimici e molecolari in seguito a trattamento con sostanze in grado di indurre stress ossidativo. Il laboratorio prevederà la semina delle cellule per la preparazione dei campioni necessari alle esperienze successive.

• SAGGIO DI DETERMINAZIONE DELLA VITALITA’ CELLULARE

• ESTRAZIONE DI PROTEINE E DOSAGGIO PROTEICO COLORIMETRICO UTILIZZANDO IL METODO DI BRADFORD

Lo scopo di questo laboratorio è l’estrazione delle proteine a partire da un pellet cellulare e la determinazione della concentrazione di proteine presente nel lisato utilizzando il metodo colorimetrico di Bradford. Il risultato ottenuto verrà utilizzato per determinare il volume di proteine da utilizzare per il saggio enzimatico e da caricare su gel

• VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’ SPECIFICA DI UN ENZIMA PRESENTE NEL LISATO CELLULARE

  Lo scopo è quello di determinare l’attività specifica dell’enzima lattico deidrogenasi presente nel lisato di cellule neuronali tramite un saggio enzimatico diretto.

• CINETICA ENZIMATICA: EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE DEL SUBSTRATO SULL’ATTIVITÀ DELL’ENZIMA.

Lo scopo e quello di determinare come varia la velocità di una reazione enzimatica in funzione del variare della concentrazione del substrato e determinare i parametri cinetici, Km e Vmax, nello specifico studieremo l’ enzima fosfatasi alcalina.

• SEPARAZIONE DI PROTEINE MEDIANTE GEL-ELETTROFORESI (SDS-PAGE)

Lo scopo di questo laboratorio è quello di separare mediante gel elettroforesi in condizioni denaturanti le proteine del lisato cellulare e determinare il peso molecolare di una proteina purificata a peso molecolare incognito.

Testi/Bibliografia

K.Wilson e J.Walker - Biochimica e Biologia Molecolare: Principi e tecniche - Cortina Editore, 2006

K.Wilson e J.Walker - Biochimica e Biologia Molecolare: Principi e tecniche – NUOVA EDIZIONE (VIII) 2019

M.Maccarrone - Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli 2019

Metodi didattici

L'insegnamento prevede 5 crediti frontali (di cui 2 di esercitazioni in aula) e 2 crediti di laboratorio, in cui verranno prese in considerazione una serie di tecniche biochimiche e la loro applicazione nella ricerca biomedica.

 

***In considerazione delle tipologie di attività e metodi didattici adottati, la frequenza di questa attività formativa richiede lo svolgimento da parte di tutti gli studenti (compresi tutti gli studenti internazionali incoming, es. ERASMUS) dei moduli 1 e 2 in modalità e-learning [https://www.unibo.it/it/servizi-e-opportunita/salute-e-assistenza/salute-e-sicurezza/sicurezza-e-salute-nei-luoghi-di-studio-e-tirocinio] e la partecipazione al modulo 3 di formazione specifica sulla sicurezza e salute nei luoghi di studio. Indicazioni su date e modalità di frequenza del modulo 3 sono consultabili nella apposita sezione del sito web di corso di studio ("studiare"--"formazione obbligatoria su sicurezza e salute"). ***

 

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

Per i moduli 1 e 2 l’esame consiste in un esame scritto su entrambi i moduli didattici, articolato in domande a risposta multipla e domande aperte.

  Per i moduli 3 e 4 (laboratorio) l’esame consisterà in un test con 11 domande sull’esperienze fatte in laboratorio. Il test durerà circa 30 minuti.

Il voto finale del Corso di Biochimica Applicata (7CFU) sarà definito dalla media pesata tra il voto relativo al modulo di laboratorio e quello relativo alla parte teorica.

Sarà oggetto di valutazione la capacità dello studente di sapersi muovere all'interno delle varie tecniche e applicazioni biochimiche. Il raggiungimento da parte dello studente di una visione organica dei temi affrontati a lezione, congiunta alla loro utilizzazione critica, la dimostrazione del possesso di una padronanza espressiva e di linguaggio specifico nelle domande aperte saranno valutati con voti di eccellenza.

Strumenti a supporto della didattica

Videoproiettore, PC, Lavagna luminosa

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Cecilia Prata

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