00062 - BIOCHIMICA APPLICATA

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso lo studente:- conosce e comprende i principi e le applicazioni delle metodologie di indagine biochimica, sia nell’ambito del laboratorio di ricerca che nell’ambito della biochimica clinica, ai fini della separazione, identificazione, caratterizzazione e analisi delle biomolecole, dei meccanismi delle attività metaboliche dei fenomeni biologici, anche in rapporto all’azione dei farmaci e dei dispositivi diagnostici per analisi biologiche.- è in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.I 2 CFU di esercitazioni uniti ai 2 CFU di laboratorio permetteranno allo studente di acquisire competenze teorico/pratiche di alcune metodologie applicate nella sperimentazione biochimica e biochimica clinica con particolare attenzione per la logica dell'impostazione degli esperimenti e della raccolta dati.

Contenuti

Modulo1 di Biochimica Applicata- (3 CFU) - Prof.ssa Cecilia Prata

Introduzione - Principii della ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica.

Cenni di Microscopia

1. Tecniche preparative

Colture cellulari: strumentazione di base di un laboratorio di colture cellulari (cappe a flusso laminare, incubatori). Colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura e tecniche di coltura.

Fluidi biologici e Anticorpi: Sangue, Plasma, Siero, Urine e altri fluidi biologici. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi per dosare anticorpi (es. Test sierologici) e anticorpi per dosare antigeni (es. Test gravidanza) cenni a tecniche immuno enzimatiche (ELISA).

Preparazione di campioni da tessuti biologici: Scelta del tampone. Omogeneizzazione (scelta delle metodiche e dei media).

Tecniche centrifugative (principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione). Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari; flottazione differenziale di lipoproteine. Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni: separazione di cellule, organelli subcellulari, proteine, acidi nucleici. Valutazione della resa e dell'arricchimento: “marcatori” subcellulari.

Metodiche di purificazione delle proteine: precipitazione frazionata di proteine con solfato d'ammonio e isoelettrica; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore. Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni.

2. Tecniche elettroforetiche

Principii generali, fattori che influenzano la mobilità elettroforetica

Elettroforesi su gel: PAGE, PAGE-SDS. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.

Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.

Blotting - Western blotting nello studio delle proteine: applicazioni biochimiche e diagnostiche.

3. Tecniche cromatografiche

Principii generali, risoluzione e piatti teorici. Cromatografia su colonna.

Cromatografia idrofobica di proteine (HIC).

Modulo 2 di Biochimica Applicata -(2 CFU_esercitazioni in aula)- Prof.ssa Romana Fato

1. Cromatografia liquida ad alta pressione:HPLC.

principali componenti di un sistema HPLC; scelta delle fasi stazionaria e mobile in funzione dell'analisi da eseguire

principali detectors associati ad un sistema HPLC.

2. Metodi di purificazione di enzimi.

scelta della tecnica di purificazione più adatta al campione in esame.

determinazione dell'attività specifica e valutazione della resa.

3. Dosaggi enzimatici.

richiami di cinetica enzimatica, ipotesi dello stato stazionario ed equazione di Michaelis-Menten.

Determinazione sperimentale della velocità delle reazioni catalizzate da enzimi: Dosaggio dell'attività enzimatica: metodi continui, discontinui, diretti, indiretti e accoppiati.

studio dell'inibizione enzimatica: inibitori competitivi, non competitivi e misti. Grafico di Lineweaver-Burk , determinazione della Ki.

Enzimi immobilizzati.

4. Tecniche di spettroscopia UV-Vis

richiami di spettroscopia UV-Vis, legge di Lambert Beer, strumentazione, cromofori.

dosaggi colorimetrici.

metodi per la determinazione del contenuto proteico di un campione biologico.

5. Tecniche spettrofluorimetriche.

richiami di spettrofluorimetria, resa quantica, decadimento di fluorescenza, strumentazione, cromofori intrinseci ed estrinseci. strumentazione.

Uso delle tecniche fluorimetriche nell'analisi qualitativa e quantitativa (linearità della relazione tra l'intensità di fluorescenza e la concentrazione della soluzione, effetto di filtro interno).

Fosforescenza e chemiluminescenza: principi di base ed applicazioni pratiche.

applicazioni biologiche delle tecniche fluorimetriche: localizzazione di fluorofori e studio di dinamiche di interazione molecolare sfruttando il fenomeno del quenching di fluorescenza (collisionale o dinamico e statico) costante di Stern-Volmer e determinazione del coefficiente di diffusione di un fluoroforo in soluzione.

trasferimento di energia per risonanza (FRET) : efficienza del trasferimento di energia, esempi di applicazione : studi di oligomerizzazione delle proteine, interazione proteina-acidi nucleici e proteina lipidi.

Fluorescenza in luce polarizzata: determinazione di anisotropia statica e dinamica: principi di base ed applicazioni allo studio delle proteine

6. tecniche di spettrocopia di assorbimento in luce polarizzata.

Dicroismo circolare: principi di base ed applicazioni per lo studio della struttura della proteine (determinazione del contenuto di alfa elica e foglietto beta). Principi di base del light-scattering e suo utilizzo per lo studio delle dimensioni di particelle (citofluorimetro).

7. applicazioni della spettrometria di massa allo studio di macromolecole biologiche.

Principi di base della spettroscopia di Massa: sorgente di ioni (Maldi, ESI), analizzatore di massa (TOF, analizzatore a quadrupolo).

Esempi di applicazione della massa per lo studio/identificazione di un polipeptide. Peptide mass fingerprinting.

Uso della spettroscopia di massa per la determinazione delle modificazioni indotte sulle proteine: grado di fosforilazione, alchilazione/acetilazione di residui aminoacidici, studio dell'interazione con farmaci ecc.

Determinazione della sequenza di proteine (sequenziamento di Edman e mediante spettrometria di massa).

8. Tecniche elettrochimiche.

Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori.

9. Tecniche di biologia molecolare.

Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali.

Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche, forensiche e paleobiologiche.

Sequenze VNTR: test di paternità. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche.

Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica.

Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray.

12. Cenni sulle applicazioni della proteomica.

Modulo 3 di Biochimica Applicata (2CFU) Prof.ssa Manuela Sollazzo

Modulo 3-4 di Biochimica Applicata (2CFU_Labortorio) Dott.ssa Manuela Sollazzo

Il laboratorio si svolgerà in due turni:

Turno A/Turno B

Al termine del laboratorio didattico di Biochimica Applicata, lo studente avrà applicato e appreso alcune tecniche per lo studio degli effetti biochimici/molecolari indotti da un composto inibente la catena respiratoria su una linea cellulare tumorale.

Il laboratorio sarà strutturato esercitazioni differenti, interconnesse fra di loro, associate ad alcune ore di spiegazione dei principi delle tecniche che saranno utilizzate durante le esperienze.

• COLTURE CELLULARI

Apprendimento delle tecniche di base per il mantenimento e la messa in coltura di linee cellulari tumorali stabili come modelli in vitro per lo studio di effetti biochimici e molecolari in seguito a trattamento con un inibitore del complesso I della catena respiratoria. Il laboratorio prevederà la semina delle cellule per la preparazione dei campioni necessari alle esperienze successive.

• SAGGIO DI DETERMINAZIONE DELLA VITALITA’ CELLULARE

Lo scopo di questo laboratorio è determinare l’effetto sulla capacità proliferativa di cellule tumorali in seguito al trattamento con inibitori del complesso I della catena respiratoria. Verrà utilizzato il saggio che utilizza sulforodamina B (SRB) come determinate delle cellule vitali.

• ESTRAZIONE DI PROTEINE E DOSAGGIO PROTEICO COLORIMETRICO UTILIZZANDO IL METODO DI BRADFORD

Lo scopo di questo laboratorio è l’estrazione delle proteine a partire da un pellet cellulare e la determinazione della miscela di proteine ottenute utilizzando il metodo colorimetrico di Bradford. Il risultato ottenuto verrà utilizzato per determinare il volume di proteine da caricare su gel.

• SEPARAZIONE DI PROTEINE MEDIANTE GEL-ELETTROFORESI (SDS-PAGE) e DETERMINAZIONE DELL’ATTIVAZIONE DI VIE DI SEGNALAZIONE

Lo scopo di questo laboratorio è quello di investigare l’attivazione del pathway di AMPK, il principale sensore dello stress energetico, in seguito ad inibizione della catena respiratoria. La tecnica utilizzata si basa sulla separazione delle proteine in base al proprio peso molecolare e di determinare in seguito a western blotting lo stato di fosforilazione della proteina AMPK.

• DETERMINAZIONE ENZIMATICA DEL CONSUMO DI GLUCOSIO IN SEGUITO A INIBIZIONE DELLA CATENA RESPIRATORIA

Lo scopo di questo laboratorio è quello di studiare l’effetto di un inibitore della catena respiratoria sulle principali vie metaboliche utilizzate dalle cellule tumorali. In particolare, attraverso la determinazione enzimatica della presenza di glucosio nel mezzo di coltura delle cellule, lo studente sarà in grado di valutare l’effetto del composto utilizzato, sulla capacità di utilizzo di glucosio come fonte di produzione di energia da parte delle cellule.

Testi/Bibliografia

K.Wilson e J.Walker - Biochimica e Biologia Molecolare: Principi e tecniche - Cortina Editore, 2006

K.Wilson e J.Walker - Biochimica e Biologia Molecolare: Principi e tecniche – NUOVA EDIZIONE (VIII) 2019

M.Maccarrone - Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli 2019

Metodi didattici

L'insegnamento prevede 5 crediti frontali (di cui 2 di esercitazioni in aula) e 2 crediti di laboratorio, in cui verranno prese in considerazione una serie di tecniche biochimiche e la loro applicazione nella ricerca biomedica.

 

***In considerazione delle tipologie di attività e metodi didattici adottati, la frequenza di questa attività formativa richiede lo svolgimento da parte di tutti gli studenti (compresi tutti gli studenti internazionali incoming, es. ERASMUS) dei moduli 1 e 2 in modalità e-learning [https://www.unibo.it/it/servizi-e-opportunita/salute-e-assistenza/salute-e-sicurezza/sicurezza-e-salute-nei-luoghi-di-studio-e-tirocinio] e la partecipazione al modulo 3 di formazione specifica sulla sicurezza e salute nei luoghi di studio. Indicazioni su date e modalità di frequenza del modulo 3 sono consultabili nella apposita sezione del sito web di corso di studio ("studiare"--"formazione obbligatoria su sicurezza e salute"). ***

 

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

Per i moduli 1 e 2 l’esame consiste in un esame scritto su entrambi i moduli didattici, articolato in domande a risposta multipla e domande aperte.

  Per i moduli 3 e 4 (laboratorio) l’esame consisterà in un test con 11 domande sull’esperienze fatte in laboratorio. Il test durerà circa 30 minuti.

Il voto finale del Corso di Biochimica Applicata (7CFU) sarà definito dalla media pesata tra il voto relativo al modulo di laboratorio e quello relativo alla parte teorica.

Sarà oggetto di valutazione la capacità dello studente di sapersi muovere all'interno delle varie tecniche e applicazioni biochimiche. Il raggiungimento da parte dello studente di una visione organica dei temi affrontati a lezione, congiunta alla loro utilizzazione critica, la dimostrazione del possesso di una padronanza espressiva e di linguaggio specifico nelle domande aperte saranno valutati con voti di eccellenza.

Strumenti a supporto della didattica

Videoproiettore, PC, Lavagna luminosa

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Cecilia Prata

Consulta il sito web di Romana Fato

Consulta il sito web di Manuela Sollazzo

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