87594 - METODOLOGIE MOLECOLARI NELLA DIAGNOSTICA E NELLA RICERCA

Scheda insegnamento

Anno Accademico 2019/2020

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso lo studente possiede solide basi teoriche e pratiche per la comprensione delle principali metodologie molecolari utilizzate in ambito di ricerca e di diagnostica.

Programma/Contenuti

1) Parte frontale del Corso (4 CFU)

 
Metodologie per l’amplificazione, la manipolazione e il sequenziamento di DNA. Partendo dai principi teorici, verranno trattati i principi molecolari alla base di tecniche per l’amplificazione del DNA (reazione di PCR), la sua analisi e manipolazione (estrazione da matrici biologiche, quantificazione, separazione elettroforetica, restrizione e modificazioni di vario tipo) e il suo sequenziamento. 


Metodologie per lo studio di molecole di RNA e per l’analisi di espressione genica. In questa parte del corso verranno affrontate metodologie per l’analisi e la quantificazione di molecole di RNA, sia in vitro che in vivo; verranno affrontate sia tecniche di analisi “gene per gene” (quali Northern Blot analysis, Primer Extension, Real Time PCR), sia metodologie che consentono un approccio “genome-wide” (quali analisi con microarrays, RNA-sequencing).


Metodologie per lo studio di proteine. Si introdurranno sia le principali metodologie per la separazione e l’analisi di proteine (quali ad esempio SDS-PAGE, gel bidimensionali, Western Blot), sia i vari sistemi di espressione e le principali strategie di purificazione di proteine ricombinanti. Verranno affrontati i principali saggi per studiare interazioni proteina-proteina e proteina-DNA.

 

Metodologia CRISPR/Cas9 e suo utilizzo per il genome-editing. Verranno trattati i principi molecolari alla base della metodologia d'avanguardia CRISPR/Cas9, facendone un confronto con le principali metodologie attualmente utilizzate per il genome-editing quali nucleasi Zinc-Finger (ZFNs) e transcription activator-like effector nucleases (TALENs).

 

2) Parte di esercitazione in laboratorio (2 CFU)

 
Durante l’esercitazione di laboratorio, della durata di 30 ore da svolgersi in una settimana, verranno svolte le seguenti attività:

- Espressione di una proteina ricombinante in cellule di Escherichia coli.
- Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità e analisi dei campioni derivanti dal processo di purificazione su gel di poliacrilammide denaturante (SDS-PAGE).
- Quantificazione della proteina purificata tramite saggio colorimetrico.
- Saggio funzionale con la proteina purificata: in vitro crosslinking e saggio di legame al DNA.

Testi/Bibliografia

Reviews ed articoli scientifici scelti in letteratura.

Metodi didattici

Lezioni frontali, analisi e discussione in aula sugli argomenti trattati e articoli scientifici.

Presentazioni PowerPoint riassuntive.

Esperienza di laboratorio a postazione individuale.

Modalità di verifica dell'apprendimento

La prova d’esame mira a verificare il raggiungimento dei principali obiettivi didattici:

1) analizzare e discutere con padronanza argomenti riguardanti le principali metodologie molecolari utilizzate in ricerca e diagnostica;
2) comprendere ed analizzare criticamente la letteratura biomolecolare in tutti i suoi aspetti;
3) progettare approcci sperimentali dettagliati su problematiche generali di carattere biomolecolare.

La prova di accertamento consisterà in un colloquio orale su tre quesiti riguardanti diverse parti del programma (verifica dell'obiettivo formativo 1 e 3). Per ogni quesito lo studente riceve un voto, in base alla capacità dimostrata di esporre in modo sintetico e compiuto le specifiche tematiche, con alcuni spunti di analisi critica. I diversi voti parziali concorrono al voto finale in trentesimi.

Strumenti a supporto della didattica

Reviews e lavori scientifici forniti dal docente.

Lavagna, PC e videoproiettore.

Laboratorio didattico di biologia molecolare a postazione singola.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Davide Roncarati