84895 - STRUTTURISTICA BIOMOLECOLARE

Scheda insegnamento

Anno Accademico 2019/2020

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede le conoscenze di base necessarie per la determinazione, a livello atomico/molecolare, della struttura di macromolecole biologiche mediante le tre tecniche principali quali la cristallografia di raggi X, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) biomolecolare, e i metodi computazionali, e saprà valutare criticamente l’opportunità di utilizzo di queste tecniche. In particolare, lo studente è in grado i) di interpretare i risultati di un'indagine strutturale ai raggi X, ii) di sviluppare le competenze necessarie ad una lettura critica di articoli contenenti strutture cristallografiche di macromolecole biologiche, e iii) di applicare le principali tecniche di cristallizzazione di proteine anche attraverso attività pratiche. Lo studente ha inoltre acquisito familiarità con gli aspetti teorici e sperimentali della spettroscopia NMR, e in particolare conosce i) le basi fisiche e teoriche della spettroscopia NMR, ii) gli esperimenti NMR utilizzati per la determinazione della struttura e della dinamica di proteine, iii) gli approcci basati sulla spettroscopia NMR per lo studio delle interazioni intermolecolari. Al termine del corso lo studente ha inoltre acquisito conoscenze, tramite esercitazioni al computer, di tutti i passaggi necessari per la determinazione della struttura di una proteina in soluzione tramite la spettroscopia NMR. Lo studente ha inoltre acquisito conoscenze teoriche e pratiche sul calcolo della struttura e della dinamica di macromolecole e complessi macromolecolari tramite tecniche di chimica computazionale applicata a proteine e metallo-proteine.

Contenuti

Biocristallografia (Prof. Simona Fermani)

Introduzione (2 ore): Organizzazione delle lezioni e modalità di verifica dell'apprendimento. Introduzione agli argomenti del programma. Introduzione alla biocristallografia, con particolare riferimento ai suoi strumenti, obiettivi e potenzialità.

Cristallizzazione di macromolecole biologiche (4 ore): Principi basilari, stadi e meccanismi del processo di cristallizzazione con particolare riferimento ai cristalli di macromolecole biologiche. Proprietà e crescita dei cristalli proteici. Principali tecniche per la cristallizzazione di macromolecole biologiche.

Basi fisiche della diffrazione di raggi X e celle elementare di un cristallo (6 ore): Caratteristiche dei raggi X, sorgenti convenzionali e luce di sincrotrone, tecniche di raccolta delle intensità di diffrazione da cristalli proteici. Principi geometrici della diffrazione e legge di Bragg. Simmetria nei cristalli ed operazioni di simmetria consentite per molecole chirali. La cella elementare e gli indici dei piani reticolari in un cristallo, posizioni ed intensità dei riflessi, risoluzione dei dati.

Problema della fase in cristallografia e metodi di risoluzione strutturale di proteine (8 ore). Il fattore di struttura come somma di Fourier; trasformata di Fourier per ottenere la densità elettronica della molecola in esame. Introduzione al problema della fase e metodi per la determinazione della fase: sostituzione molecolare (Molecular Replacement), sostituzione isomorfa (SIR e MIR), scattering anomalo (SAD e MAD, SIRAS e MIRAS). Miglioramento delle fasi e affinamento del modello. Validazione della struttura cristallografica e deposito nella banca dati Protein Data Bank.

Il corso prevede una parte di esercitazione in laboratorio (10 ore): Cristallizzazione di una proteina campione mediante elaborazione di una procedura individuale di lavoro sulla base di alcuni data come tipo di precipitante e concentrazione di proteina, tampone e precipitante. Esame dei cristalli ottenuti al microscopio per valutarne la qualità e scelta dei campioni adatti all’indagine a RX. Esercitazione con uso di software Coot adeguato per la visualizzazione del modello di proteina ottenuto, delle mappe di densità elettronica, dei processi di map fitting e della regolarizzazione del modello.

Spettroscopia NMR Biomolecolare (Prof. Stefano Ciurli).

Introduzione (2 ore): organizzazione delle lezioni e modalità di verifica dell'apprendimento. Introduzione agli argomenti del programma. Presentazione della spettroscopia NMR biomolecolare, dei suoi strumenti e dei suoi obiettivi.

Basi fisiche della spettroscopia NMR (6 ore): basi elementari dell’elettromagnetismo. Momento angolare di spin nucleare. Isotopi NMR attivi. Magnetismo nucleare. Energia di un nucleo magnetico in un campo magnetico esterno. Rapporto giromagnetico. Equazione di Larmor e frequenza di eccitazione nucleare magnetica. Magnetismo microscopico e macroscopico. Moti di precessione magnetica. Magnetizzazione e rilassamento longitudinale e trasversale. Principi di funzionamento dello spettrometro NMR. Visualizzazione del fenomeno NMR tramite software dedicato. Spettroscopia CW-NMR e rapporto segnale/rumore negli spettri NMR. Spettroscopia FT-NMR e rapporto segnale/rumore negli spettri NMR. Principi base della trasformata di Fourier e sua visualizzazione tramite software dedicato. Procedure di processing del segnale NMR per l’ottenimento dello spettro: digitalizzazione, zero-filling, apodizzazione, trasformata di Fourier, correzione della fase e della linea di base in spettri mono- e multi-dimensionali.

Basi chimiche della spettroscopia NMR applicata alle proteine (4 ore): parametri dello spettro NMR: scala di energia e, chemical shift, Il chemical shift e la struttura degli aminoacidi. Il chemical shift e la struttura secondaria delle proteine. Molteplicità del segnale e accoppiamento scalare (through-bond). Angoli diedri e costanti di accoppiamento, relazione di Karplus. Intensità del segnale e fenomeni di rilassamento. L’effetto nucleare Overhauser (NOE) through-space. Metodi computazionali (Dott. Francesco Musiani). Modellizzazione molecolare, sistemi di coordinate, meccanica molecolare, rappresentazione di atomi e molecole, campi di forza empirici, superfici di energia potenziale, interazioni elettrostatiche, minimizzazione dell’energia e metodi per l’esplorazione della superficie di energia potenziale, metodi di simulazione, dinamica molecolare e metodi per l’esplorazione accelerata della superficie di energia potenziale, predizione della struttura proteica, riconoscimento molecolare (docking) macromolecola – piccola molecola e macromolecola – macromolecola.

Spettroscopia NMR multidimensionale (4 ore): sequenze di impulsi per spettri mono-dimensionali e multi-dimensionali. Illustrazione di spettri COSY e TOCSY di aminoacidi. Approccio omo-nucleare per l’assegnamento sequenza-specifico tramite spettri COSY-TOCSY-NOESY omo-nucleari. Spettri etero-nucleari HSQC. Descrizione di sequenze di impulsi tri-dimensionali: NOESY-TOCSY, NOESY-HSQC. Descrizione di esperimenti NMR in tripla risonanza per l’assegnamento dei nuclei del backbone proteico: HNCO/HNcaCO, HNCA/HNcoCA, HNCACB/CBCAcoNH, HBHANH, HBHAcoNH. Descrizione di esperimenti NMR in tripla risonanza per l’assegnamento dei nuclei delle catene laterali delle proteine: hCCcoNH, HccccoNH, hCCH-TOCSY. Misura delle costanti di accoppiamento scalare con esperimenti HNHA.

Determinazione della struttura delle proteine mediante utilizzo dei parametri derivati dagli spettri NMR (12 ore): 

Basi teoriche del calcolo della struttura NMR in soluzione tramite Torsion Angle Dynamics (TAD). Descrizione dei software UNIO, ATNOS, CANDID, CARA, CYANA. Discussione critica del confronto tra strutture NMR, cristallografiche e modelli teorici. Esercitazione al computer, in postazione singola. Utilizzo del programma CARA (Computer Assisted Resonance Assignment) per l’assegnamento sequenza-specifico dei nuclei del backbone proteico dell’ubiquitina con spettri HNCO/HNcaCO, HNCA/HNcoCA, HNCACB/CBCAcoNH. Utilizzo del programma CYANA per il calcolo della struttura di una proteina a partire da vincoli strutturali di distanze e angoli diedri.

Metodi computazionali (Dott. Francesco Musiani)

Introduzione (1 ora): Organizzazione delle lezioni e modalità di verifica dell'apprendimento. Introduzione agli argomenti del programma. Presentazione della strutturistica molecolare computazionale, dei suoi strumenti e dei suoi obiettivi.

Meccanica molecolare e campi di forza empirici (3 ore): Richiamo ai modelli atomici e al concetto di legame chimico. Sistemi di coordinate. Meccanica molecolare. Rappresentazione di atomi e molecole. Superfici di energia potenziale. Campi di forza empirici. Interazioni elettrostatiche. Interazioni intermolecolari. Forze di van der Waals. Polarizzabilità. Legami a idrogeno. Minimizzazione dell’energia.

Dinamica molecolare (teoria, 2 ore): Metodi per l’esplorazione della superficie di energia potenziale. Metodi di simulazione. Dinamica molecolare e cenni ai metodi per l’esplorazione accelerata della superficie di energia potenziale. Box di simulazione. Solvente implicito ed esplicito. Insiemi termodinamici. Termostato e pressostato.

Modellizzazione per omologia e riconoscimento molecolare (teoria, 2 ore): Principi della modellizzazione per omologia. Data base di sequenze proteiche. Allineamento di sequenze. Predizione della struttura proteica. Modellizzazione dei loop. Riconoscimento molecolare (docking) macromolecola - piccola molecola e macromolecola - macromolecola. Valutazione dei modelli.

Esercitazione di modellizzazione per omologia (4 ore): Introduzione al sistema operativo Linux. Richiami all’uso del programma di visualizzazione molecolare UCSF Chimera. Applicazione del programma Modeller per la modellizzazione di una metallo proteina. Ottimizzazione, valutazione e analisi del modello ottenuto.

Esercitazione di riconoscimento molecolare (4 ore): Utilizzo del programma DOCK e riconoscimento molecolare proteina - piccola molecola. Utilizzo del programma Haddock e riconoscimento molecolare proteina - proteina. Valutazione e analisi dei risultati.

Esercitazione di dinamica molecolare (4 ore): Utilizzo del programma GROMACS. Setup di un sistema di dinamica molecolare in solvente esplicito. Minimizzazione, equilibrazione del solvente e dinamica di produzione. Analisi dei risultati.

Testi/Bibliografia

Gale Rhodes "Crystallography made crystal clear" III ed., Academic Press 2006

Alexander McPherson "Introduction to macromolecular crystallography" J. Wiley 2003

Ken Keeler “Understanding NMR Spectroscopy, Wiley, 2002

Andrew L. Leach “Molecular modelling” Pearson Education 2001

NMR e metodi computazionali: il docente metterà a disposizione degli studenti il relativo materiale didattico.

Metodi didattici

Le lezioni saranno svolte in aula con uso di presentazioni multimediali e saranno completate da una parte di esercitazioni in laboratorio.

Modalità di verifica dell'apprendimento

Biocristallografia: l’esame finale consiste in un colloquio orale per valutare la conoscenza dell'argomento da parte degli studenti. La prova orale sarà preceduta da una presentazione, in cui lo studente dovrà commentare i risultati ottenuti dalle esercitazioni di laboratorio.

NMR: l'esame finale consiste in un test contenente domande e problemi numerici ed in un eventuale colloquio. Il risultato del test non preclude l'accesso all'orale ma sarà considerato nella valutazione del voto finale. 

Metodi computazionali: l’esame finale consiste in un colloquio orale per valutare la conoscenza dell'argomento da parte degli studenti. La prova orale sarà preceduta da una presentazione, in cui lo studente dovrà discutere un articolo scientifico inerente il programma del modulo e assegnato con largo anticipo e rispondere a domande inerenti la presentazione e il programma del modulo.

Strumenti a supporto della didattica

Files in formato pdf relativi al programma svolto disponibili nel sito web docente.

Esercitazioni di cristallizzazione di una proteina, scelta del campione più opportuno, raccolta dati di diffrazione ai raggi X ed utilizzo di un software di visualizzazione ed ottimizzazione del modello strutturale ottenuto

Esercitazioni su assegnamento sequenza-specifico di segnali di risonanza magnetica nucleare, processando ed analizzando dati di spettri NMR in tripla risonanza. Esercitazione sulla determinazione della struttura di una proteina usando dati NMR.

Esercitazioni su modellizzazione per omologia di una metallo proteina, riconoscimento molecolare proteina – piccola molecola e proteina – proteina, e valutazione della qualità di un modello molecolare. Esercitazione sulla preparazione di un sistema proteico per la dinamica molecolare, minimizzazione dell’energia, esecuzione di calcoli di dinamica molecolare ed analisi dei risultati.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Stefano Luciano Ciurli

Consulta il sito web di Simona Fermani

Consulta il sito web di Francesco Musiani