66609 - BIOCHIMICA (B)

Scheda insegnamento

Anno Accademico 2019/2020

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente conosce: - i processi biologici a livello molecolare; - i rapporti struttura-funzione delle biomolecole con particolare riguardo alle proteine; - il metabolismo energetico; - una visione integrata di signalling e metabolismi principali; - le corrette procedure per il lavoro in condizioni sterili e le principali tecniche di base per le colture cellulari animali; - le basi di biochimica strutturale e di enzimologia; - i principali metodi di dosaggio delle proteine in spettrofotometria; - l'impiego di protocolli sperimentali per il calcolo dell'attività specifica degli enzimi. Lo studente sa inoltre valutare criticamente i risultati ottenuti tramite la stesura di una relazione riguardante gli esperimenti effettuati.

Programma/Contenuti

Modulo 1 (6CFU) docente: Prof. Romana Fato

1.Struttura e Funzione delle Macromolecole Biologiche
  • Struttura e proprietà degli amminoacidi; organizzazione strutturale delle proteine: struttura primaria, secondaria, terziaria e quaternaria.
  • Proteine fibrose e globulari.
  • Relazione struttura e funzione delle proteine: Emoglobina e mioglobina. Struttura dell'eme. Curve di saturazione per l'ossigeno e cooperatività.
  • 2. Fondamenti di Bioenergetica.
  • Termodinamica e spontaneità dei processi metabolici: Definizione e significato biologico dell’energia libera; relazione tra energia libera, entropia, entalpia e costante di equilibrio.
  • Meccanismi di trasferimento dell’energia: reazioni energeticamente accoppiate
  • Molecole biologiche ad alta energia: composti fosforilati ad alta energia e nucleotidi ridotti
  • L’ATP ed il potenziale di trasferimento del gruppo fosforico.
  • 3. Enzimologia.
  • Enzimi: classificazione degli enzimi. La catalisi enzimatica. Energia di attivazione. Struttura e proprietà generali degli enzimi. Cofattori e coenzimi.
  • Cinetica enzimatica: Km, Vmax, kcat. L'equazione di Michaelis-Menten. Effetto del pH e della temperatura sull'attività enzimatica.
  • Inibizione dell'attività enzimatica: inibizione reversibile competitiva e non competitiva.
  • Regolazione dell'attività enzimatica: enzimi allosterici e cooperatività, modulatori positivi e negativi; reversibili modificazioni, irreversibili e covalenti.
  • 4.Lipidi e membrane biologiche
  • Classificazione dei lipidi: acidi grassi, i trigliceridi, i glicerofosfolipidi, sfingolipidi e steroidi.
  • Struttura delle membrane biologiche: caratteristiche chimico fisiche dei doppi stati fosfolipidici. Modello a mosaico fluido e diffusione laterale dei lipidi e delle proteine di membrana.Cenni sui lipid rafts.
  • Principali funzioni delle membrane. Trasporto di molecole attraverso le membrane: sistemi di diffusione semplice, trasporto passivo, trasporto attivo primario e secondario; canali ionici selettivi.
  • 5. Metabolismo
  • Organizzazione generale delle vie metaboliche e loro compartimentazione
  • catabolismo e anabolismo: relazione tra vie di degradazione e di biosintesi, i cicli del substrato.
  • Definizione della tappa di comando di una via metabolica, meccanismi di controllo e ruolo dell’ATP nella spontaneità delle vie metaboliche.
  • Uni direzionalità delle vie metaboliche e regolazione del flusso nelle vie metaboliche.
  • 6. Metabolismo degli zuccheri.
  • La glicolisi: Il destino del piruvato in condizione aerobiche e anaerobiche; regolazione della glicolisi.
  • La via dei pentoso fosfati.
  • Gluconeogenesi e metabolismo del glicogeno. Metabolismo del glicogeno: reazioni di degradazione e di biosintesi. Meccanismi di regolazione coordinata della sintesi e della demolizione del glicogeno. Gluconeogenesi: substrati e reazioni della gluconeogenesi. Meccanismi di regolazione della gluconeogenesi.
  • Cenni sul metabolismo di altri monosaccaridi (fruttosio, galattosio).
  • 7. Il ciclo dell’acido citrico e la fosforilazione ossidativa
  • La produzione di acetil-Coenzima A. Il complesso della piruvato deidrogenasi ed i suoi cinque cofattori. Meccanismi di regolazione della piruvato deidrogenasi.
  • Ciclo degli acido citrico: reazioni del ciclo, meccanismi di regolazione e interrelazioni con altri metabolismi (ruolo delle reazioni anaplerotiche).
  • Trasporto di elettroni e fosforilazione ossidativa: struttura tridimensionale dei trasportatori di elettroni nella catena respiratoria mitocondriale.
  • Sintesi di ATP: ruolo del gradiente protonico trans-membrana nella sintesi di ATP. Struttura dell’ATP sintasi.
  • Regolazione della fosforilazione ossidativa: fabbisogno energetico cellulare, ruolo dei disaccoppianti nella termogenesi. Ipossia e produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS).
  • 8. Metabolismo lipidico.
  • Digestione, mobilizzazione e trasporto degli acidi grassi.
  • Catabolismo degli acidi grassi: reazioni della β-ossidazione.
  • La formazione e l'uso di corpi chetonici.
  • Biosintesi degli acidi grassi: reazioni e regolazione. Allungamento e desaturazione degli acidi grassi.
  • Cenni sulla biosintesi dei trigliceridi e fosfolipidi.
  • Colesterolo, steroidi ed isopreni: biosintesi, regolazione e trasporto.
  • 9. Degradazione degli aminoacidi e produzione dell’urea.
  • Destino metabolico dei gruppi amminici: reazioni di transaminazione e di deaminazione ossidativa.
  • Ciclo dell’urea: localizzazione delle reazioni del ciclo e interconnessioni del ciclo dell’urea con il ciclo dell’acido citrico.
  • 10. Cenni di trasduzione del segnale.
  • Vie di segnalazione cAMP-e fosfato-inositolo dipendente. Recettori con attività tirosin-chinasica e meccanismi di fosforilazione a cascata.

 

Modulo 2 (3 CFU) Docenti: Prof. Giovanna Farruggia [Sdoppiamento A] ‐ Laboratorio Di Biochimica Cellulare Gr A; Prof Concettina Cappadone [Sdoppiamento B].- Laboratorio Di Biochimica Cellulare Gr B

I 3 crediti del modulo di Laboratorio di Biochimica cellulare andranno a costituire un laboratorio integrato nella attività formativa del Corso integrato di Biochimica. Il laboratorio è collocato all’inizio del corso e introdurra’ gli studenti all’apprendimento delle basi delle colture cellulari animali e allo studio degli enzimi. Gli studenti impareranno ad utilizzare le cellule adese e in sospensione e a preparare un lisato proteico. Parallelamente valuteranno i parametri cinetici di un enzima purificato e la dipendenza dell’attivita’ enzimatica dal pH. In particolare il laboratorio prevede:

  1. Preparazione di vetrini e colorazione delle cellule con il metodo di May-Grunwald/Giemsa
  2. Valutazione della morte cellulare in microscopia in campo chiaro e a fluorescenza
  3. Preparazione di un lisato cellulare
  4. Determinazione del contenuto proteico del lisato con il metodo di Bradford
  5. Elettroforesi su gel di poliacrilamide del lisato cellulare
  6. Determinazione della Vmax e Km dell’enzima lattico deidrogenasi
  7. Determinazione dell’effetto del pH sull’attività dell’enzima tripsina

Alla fine del laboratorio e’ prevista una sessione di analisi dei dati raccolti valutati singolarmente e globalmente. Le modalita’ di stesura di una relazione scientifica saranno discusse collegialmente partendo appunto dai dati raccolti.

Oltre alla parte pratica, si farà una limitata parte teorica riguardante:

  1. La coltura di cellule animali
  2. Le principali tecniche utilizzate:
    1. Spettroscopia UV visibile
    2. Spettroscopia di fluorescenza
    3. Microscopia
    4. Tecniche elettroforetiche


Testi/Bibliografia

Moulo 1

Berg, Tymoczko, Stryer   "Biochimica"  Zanichelli editore
Nelson, Cox   "I principi di Biochimica di Lehninger" Zanichelli editore

Garret e Grisham "Biochimica" V edizione Piccinin editore

 

Biochimica Molecole e metabolismo • Con Mastering Chemistry™ Dean R. Appling - Spencer J. Anthony-Cahill - Christopher K. Mathews Pearson editore

Modulo 2

Per il laboratorio saranno date agli studenti delle schede riguardanti lo svolgimento dei singoli esperimenti. Inoltre sarà fornito tutto il materiale utilizzato nello svolgimento delle lezioni teoriche. Non si richiede nessun testo in particolare.


 

Metodi didattici

modulo 1: Lezioni frontali
modulo 2:Lavoro individuale in laboratorio e di gruppo per l’analisi dei dati. La frequenza al laboratorio e’ obbligatoria.

Modalità di verifica dell'apprendimento

La verifica dell'apprendimento al termine del corso si propone di valutare il raggiungimento dei seguenti obiettivi:

Modulo di Biochimica 1

- Conoscere la struttura e funzione delle principali macromolecole biologiche  e le nozioni fondamentali di enzimologia.

- Conoscere la bioenergetica cellulare, le principali vie metaboliche e i meccanismi sottesi alla loro regolazione e alla trasduzione del segnale.

- Conoscere i meccanismi molecolari di base dei sistemi viventi, e la logica molecolare della loro regolazione.

Modulo di Biochimica 2

-Conoscenza delle principali tecniche di base per le colture cellulari

-Conoscenza dei principali metodi di dosaggio delle proteine

-Conoscenza dei metodi sperimentali per il dosaggio dell'attività enzimatica

 

L'esame consiste in una valutazione su una relazione scritta su di una attività di laboratorio del Modulo di Biochimica 2 ed una prova orale per la valutazione del modulo di Biochimica 1. La registrazione su Alma Esami verrà fatta solo dopo il superamento di entrambe le prove.

 

Modulo di Biochimica1: l'esame consiste in una prova orale, della durata di 20-30 minuti, con tre domande che tenderanno ad accertare la conoscenza teorica da parte dello studente sulla struttura e funzione della macromolecole biologiche, sul metabolismo e sua regolazione.

 

Modulo di Biochimica 2:Durante tutto il percorso di laboratorio gli studenti saranno seguiti dai docenti titolari dei due moduli e da tutors, con un costante dialogo volto a chiarire sia il percorso analitico effettuato che i singoli esperimenti. LIl superamento dell’esame prevede la presentazione di una relazione, elaborata secondo le modalità presentate nell’ultima giornata del laboratorio, che dovrà essere consegnata entro una settimana dal termine del laboratorio.

La valutazione espressa in 30esimi, concorrera’ al voto finale, determinato come media pesata dei diversi moduli.

 

Il voto finale del corso sarà determinato come media pesata dei due moduli.

Strumenti a supporto della didattica

Modulo 1 :power point slides
Modulo 2 : laboratorio pratico dotato di spettrofotometri e bagni termostatici.  laboratorio informatico con Computer a postazione singola. laboratorio di colture cellulari.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Romana Fato

Consulta il sito web di Concettina Cappadone