72575 - FISIOLOGIA DEGLI STRESS E DINAMICHE REDOX NELLE PIANTE

Scheda insegnamento

Anno Accademico 2018/2019

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite dei moderni sviluppi in alcuni ambiti specifici della fisiologia vegetale e delle principali metodologie finalizzate all'espressione di proteine ricombinanti vegetali e alla loro caratterizzazione. In particolare, lo studente è in grado di: - analizzare e discutere con padronanza argomenti di genomica, biologia redox, fisiologia degli stress abiotici e biotici delle piante superiori; - valutare in modo critico la letteratura scientifica relativa agli argomenti trattati; - analizzare frammenti di DNA e trasformare cellule batteriche; - purificare proteine ricombinanti mediante tecniche cromatografiche; - condurre analisi biochimiche e molecolari di caratterizzazione del prodotto proteico.

Programma/Contenuti

Il corso comprende il Modulo 1 (lezioni frontali, 4 CFU, Prof. Trost) e il Modulo 2 (laboratorio sperimentale individuale, 3 CFU, Dott.ssa Sparla).

Modulo 1:

Arabidopsis thaliana come specie modello in biologia vegetale. Genoma nucleare e del plastidio. Trasferimento genico endosimbiontico. 

Stess ossidativo e redox signalling. Produzione e detossificazione di ROS nelle piante. Fotosintesi e fotoinibizione. Mitocondri. NADPH-ossidasi. Segnalazione redox basata sulle cisteine.  

Stress abiotici. Stress idrico: aggiustamento osmotico e acido abscissico.

Stress biotici. Classi di fitopatogeni e patogenesi. Difese costitutive delle piante. Immunità basale e resistenza verticale (ipotesi guardia e modello gene per gene). Scoppio ossidativo, monossido d'azoto e risposta ipersensibile. Risposte sistemiche.

Modulo 2:

1° giorno: estrazione di DNA plasmidico ed analisi mediante endonuclesi di restrizione.
Calcoli e discussione.

2°giorno: trasformazione di cellule di E. coli BL21(DE3) e selezione dei trasformanti su terreno con kanamicina.
NBT-staining per verificare la produzione di ROS in risposta a ferita in foglie di A. thaliana.

3° giorno: rilancio in coltura liquida di una colonia cresciuta su piastra.
Separazione in SDS-page e successivo Western blot di proteine vegetali.

4° giorno: induzione dell'espressione della proteina ricombinante mediante IPTG; curva di crescita batterica.
Incubazione con anticorpo secondario coniugato alla fosfatasi alcalina e rilevazione colorimetrica.
Calcoli e discussione.

5° giorno: lisi cellulare e purificazione della proteina ricombianante mediante cromatografia ad interazione metallica; desalting del campione proteico.

6° giorno:  valutazione mediante gel elettroforesi denaturante del grado di purificazione della proteina ricombinante; misurazione della concentrazione proteica.
Calcoli e discussione.

7° giorno:  misurazione dell'attività cinetica dell'enzima ricombinante e analisi di trasferimento bi-elettronico.
Calcoli e discussione.

8° giorno:  spettri d'assorbimento della proteina ricombinante; valutazione della natura del cofattore flavinico.
Calcoli e conclusioni finali.

Testi/Bibliografia

- Rascio et al., Elementi di fisiologia vegetale, EdiSes Napoli, seconda edizione 

- Taiz, Zeiger, Plant physiology, quinta edizione, Sinauer Associates

- Reviews aggiornate sugli argomenti principali (fornite dal docente)

- Lezioni power point 

- Protocollo dettagliato dell'intero laboratorio

Metodi didattici

Modulo 1: lezioni frontali
Modulo 2 (laboratorio): ogni studente è tenuto a svolgere l'attività sperimentale di laboratorio in modo individuale. Il docente svolgerà una parte teorica di introduzione al laboratorio e continua assistenza tecnica. Discussione comune finale dei risultati ottenuti.

Modalità di verifica dell'apprendimento

Alla fine del laboratorio gli studenti dovranno superare un test scritto di verifica dell'attività sperimentale svolta, superato il quale sarà possibile accedere all'esame orale sulle tematiche del Modulo 1.

Strumenti a supporto della didattica

Il corso si svolgerà in aule dotate di proiezione da PC. Tutte le lezioni saranno svolte con l'ausilio di mediante presentazioni power point. I file delle presentazioni power point saranno messi a disposizione degli studenti alla fine del corso (file scaricabili da AMSCAMPUS). Il corso di laboratorio si svolgerà in un laboratorio didattico a postazione singola, attrezzato con centrifughe, spettrofotometri e celle elettroforetiche.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Paolo Bernardo Trost

Consulta il sito web di Francesca Sparla