72568 - BIOCHIMICA DELLA SEGNALAZIONE CELLULARE CON LABORATORIO

Scheda insegnamento

Anno Accademico 2018/2019

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede conoscenze approfondite dei principali meccanismi biochimici di segnalazione intracellulare e dell'interazione funzionale tra organelli. Acquisisce inoltre esperienza pratica delle principali tecniche di coltivazione di cellule in vitro e delle metodologie per studiare la vitalità/morte cellulare e l' efficienza energetica, sia in popolazioni cellulari che analizzando le funzioni cellulari in singola cellula in vivo mediante sonde fluorescenti. In particolare, lo studente è in grado di: - analizzare e discutere con padronanza argomenti di biochimica cellulare; - individuare le metodologie più efficaci per risolvere problemi biologici specifici; - effettuare analisi accurate per identificare alterazioni delle funzioni energetiche cellulari.

Programma/Contenuti

Mitocondri: crocevia della segnalazione cellulare

La bioenergetica rivisitata

Strategie sperimentali per studiare l’efficienza energetica mitocondriale nelle cellule: nuovi metodi per la misura del consumo di ossigeno in cellule; misure qualitative del potenziale elettrico mitocondriale: caratteristiche delle diverse sonde e uso combinato di inibitori specifici per evidenziare disfunzioni energetiche. Organizzazione sopramolecolare dei complessi respiratori: studio mediante la tecnica BN-PAGE. Concetto di respirasoma e dimostrazione sperimentale. Funzione dei supercomplessi nella fisiologia e patologia.

Ultrastruttura dei mitocondri

Nuove acquisizione dell'ultrastruttura dei mitocondri mediante analisi tomografica e crio-microscopia elettronica: le cristae e le cristae junctions: nuova organizzazione molecolare della membrana interna mitocondriale e implicazioni funzionali; ruolo strutturale del complesso V evidenziate mediate crio-EM. Il complesso MICOS: contatti tra membrana esterna ed interna e tra membrana esterna e reticolo endoplasmico.

Il genoma mitocondriale

Caratteristiche generali, organizzazione e componenti dei nucleoidi. Mutazioni del genoma mitocondriale e concetto di eteroplasmia; il modello cellulare dei cibridi. Cenni sulle malattie mitocondriali e neurodegenerazione.

La dinamica del reticolo mitocondriale

Caratteristiche morfologiche del reticolo mitocondriale: studi in vivo mediante proteine fluorescenti ricombinanti e FRAP. Le GTPasi coinvolte nella dinamica del reticolo mitocondriale: fissione e Drp1: struttura, funzione e regolazione. Relazione tra le proteina delle dinamica ed apoptosi. Fusione alla membrana esterna: le mitofusine-1 e -2: la nuova topologia e problematiche relative alla fusione mitocondriale; modalità di interazioni tra mitocondri ed ER. Misure della fusione mitocondriale. OPA1, una proteina multifunzionale: regolazione della struttura delle cristae ed apoptosi; isoforme e stabilità del mtDNA.

Mitocondri e oncometaboliti 

Dall’effetto Warburg alla riprogrammazione metabolica nei tumori; tumorigenesi, mitocondri e mutazioni nel mtDNA; ruolo nella stabilizzazione del fattore di trascrizione HIF1-alfa nella riprogrammazione metabolica. Struttura di HIF1-alfa e modificazione covalente da idrossilazione: meccanismo catalitico delle prolil-idrossilasi; ipossia e pseudo-ipossia. Oncometaboliti e tumori causati da mutazioni negli enzimi del ciclo di Krebs. Basi  molecolari della riprogrammazione metabolica dei tumori.

 

I lisosomi: un nuovo scenario della segnalazione cellulare

Non solo smaltimento dei rifiuti. Componenti del lume e della membrane dei lisosomi; H+-ATPasi-V e il pH vacuolare.

Il  complesso TORC1: componenti ed interattori. Ruolo nel metabolismo cellulare tra proliferazione ed autofagia.  TFEB e biogenesi dei lisosomi.

 

I secondi messaggeri

Calcio. Concetto di "calcium-signalling toolkit"; meccanismi ON e OFF: trasportatori e canali delle varie membrane cellulari e omeostasi; Altri mobilizzatori di calcio: cADPR e NAADP: biosintesi e funzione.

La rivoluzione delle sonde per la misura della concentrazione del calcio citosolico: struttura e caratteristiche del fura-2. Aspetti temporali e spaziali della segnalazione di calcio: onde, oscillazioni e meccanismi ipotizzati. Entrata capacitativa di calcio nella membrana plasmatica: ruolo delle proteine Stim e Orai1.

La seconda rivoluzione delle proteine “indirizzate” per misure di calcio nei compartimenti intracellulari; aequorina indirizzata alla matrice mitocondriale e scoperta dei microdomini di calcio ER-mitocondri. Sonde tipo Camaleon per lo studio delle relazioni ER-mitocondri. Meccanismo di entrata di calcio nei mitocondri: il puzzle del complesso MCU; calcio nella matrice e regolazione degli enzimi del ciclo di Krebs, del metabolismo cellulare e dell'autofagia.

AMP ciclico. Proteine ricombinanti per la misura di AMP ciclico in vivo; elementi che definiscono gli aspetti spazio temporali della sua segnalazione da cAMP: adenilato ciclasi, fosfodiesterasi, proteine AKAPs.

 

Il laboratorio sperimentale consiste in una seria di lezioni frontali e da una parte sperimentale. Nelle lezioni teoriche vengono illustrate e discusse le principali tecniche per la coltivazione di cellule animali in coltura.

Nella parte pratica ogni studente esegue una serie di esperimenti in cui impara ad analizzare e propagare alcuni tipi di cellule di mammifero in coltura. Inoltre, utilizzando semplici metodologie biochimiche, acquisisce competenze per misurare la vitalità cellulare, per evidenziare alterazioni morfologiche, per determinare variazioni metaboliche.

Gli esprimenti consistono in:

1. Osservazione al microscopio ottico di cellule che crescono in adesione, tripsinizzazione, conta e semina;

2. Misura del metabolismo glicolitico  mediante dosaggio di metaboliti con saggi spetttrofotometrici;

3. Immunofluorescenza per l'analisi della morfologia del reticolo mitocondriale mediante microscopia a fluorescenza;

4. Determinazione della vitalità cellulare mediante saggio colorimetrico: effetto dello stress metabolico.

Testi/Bibliografia

Il docente fornità le indicazioni bibliografiche (rassegne e lavori originali). I files PDF con il materiale illustrato durante le lezioni saranno a disposizione degli studenti, previa iscrizione alla lista di distribuzione del docente e accesso al sito AMS Campus, utilizzando la password fornita dal docente.

Metodi didattici

Durante le lezioni verranno illustrate e discusse alcune importanti problematiche della segnalazione cellulare. Il corso teorico è affiancato da un laboratorio sperimentale, in cui ciascun studente potrà effettuare una serie di esperimenti semplici, imparando le metodologie di base per lo studio delle funzioni cellulari, quali spettrofotometria, microscopia ottica e a fluorescenza, etc. Imparerà inoltre le procedure fondamentali per manipolare e propagare cellule in coltura.  Queste attività saranno programmate in modo che lo studente sia in grado di definire strategie sperimentali per affrontare alcuni problemi delineati in forma teorica durante le lezioni.

Modalità di verifica dell'apprendimento

La prova di verifica dell'apprendimento é orale e prevede una serie di domande, che tenderanno ad accertare la conoscenza da parte dello studente degli argomenti svolti a lezione.

Per quanto riguarda la verifica dell'apprendimento della parte riguardante il laboratorio sperimentale, si effettuerà un test scritto, che  consiste in quesiti (domante aperte e a risposta multipla), che fanno riferimento alle metodologie e alle procedure eseguite nelle esperienze di laboratorio.

Strumenti a supporto della didattica

presentazioni ppt; lavori scientifici

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Michela Rugolo