00062 - BIOCHIMICA APPLICATA

Scheda insegnamento

Anno Accademico 2018/2019

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso lo studente - acquisisce le conoscenze di base delle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi di biomolecole; - è in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.

Contenuti

Modulo1 di Biochimica Applicata- (3 CFU) - Dott.ssa Cecilia Prata
 
Introduzione. Principii della ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica. Cenni di Microscopia.

1. Tecniche preparative

  • Colture cellulari: strumentazione di base di un laboratorio di colture cellulari (cappe a flusso laminare, incubatori).
  • colture cellulari primarie e linee cellulari. terreni di coltura e tecniche di coltura.
  • Soluzioni-tampone e pH: scelta dei tamponi per uso biochimico. Amminoacidi e punto isoelettrico.
  • preparazione di campioni ta tessuti biologici: Omogenizzazione (scelta delle metodiche e dei media), tecniche centrifugative (principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione).
  • Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari; flottazione differenziale di lipoproteine. Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni: separazione di cellule, organelli subcellulari, proteine, acidi nucleici. Valutazione della resa e dell'arricchimento: “marcatori” subcellulari.
  • metodiche di purificazione delle proteine: precipitazione frazionata di proteine con solfato d'ammonio e isoelettrica; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore. Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni.

 

2. Tecniche elettroforetiche.

  • Tecniche elettroforetiche: principii generali, fattori che influenzano la mobilità elettroforetica. Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa; proteine seriche. Elettroforesi su gel: PAGE, PAGE-SDS. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.
  • Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale.
  • Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative. Blotting - Western blotting nello studio delle proteine: applicazioni biochimiche e diagnostiche.

3. Tecniche cromatografiche.

  • principii generali, risoluzione e piatti teorici. Cromatografia su colonna.
  • Cromatografia di adsorbimento e ripartizione. Cenni sulla TLC: cromatografia bidimensionale. Cromatografia idrofobica di proteine (HIC).
  • Cromatografia a scambio ionico di proteine. Analizzatore automatico di amminoacidi.
  • Cromatografia ad esclusione (gel filtrazione).
  • Cromatografia di affinità. Immunoaffinità. Cromatografia con coloranti e con lectine.
  • Cromatografia con metalli; purificazione di proteine “etichettate” con istidina. Purificazione di proteine ricombinanti.

    Modulo 2 di Biochimica Applicata -(5 CFU)- Prof.ssa Romana Fato

 

1. Cromatografia liquida ad alta pressione:HPLC.

  • principali componenti di un sistema HPLC; scelta delle fasi stazionaria e mobile in funzione dell'analisi da eseguire
  • principali detectors associati ad un sistema HPLC.

2. Metodi di purificazione di enzimi.

  • scelta della tecnica di purificazione più adatta al campione in esame.
  • determinazione dell'attività specifica e valutazione della resa.

3. Dosaggi enzimatici.

  • richiami di cinetica enzimatica, ipotesi dello stato stazionario ed equazione di Michaelis-Menten.

  • Determinazione sperimentale della velocità delle reazioni catalizzate da enzimi: Dosaggio dell'attività enzimatica: metodi continui, discontinui, diretti, indiretti e accoppiati.

  • studio dell'inibizione enzimatica: inibitori competitivi, non competitivi e misti. Grafico di Lineweaver-Burk , determinazione della Ki.

  • Enzimi immobilizzati.

4. Tecniche di spettroscopia UV-Vis

  • richiami di spettroscopia UV-Vis, legge di Lambert Beer, strumentazione, cromofori.

  • dosaggi colorimetrici.

  • metodi per la determinazione del contenuto proteico di un campione biologico.

5. Tecniche spettrofluorimetriche.

  • richiami di spettrofluorimetria, resa quantica, decadimento di fluorescenza, strumentazione, cromofori intrinseci ed estrinseci. strumentazione.

  • Uso delle tecniche fluorimetriche nell'analisi qualitativa e quantitativa (linearità della relazione tra l'intensità di fluorescenza e la concentrazione della soluzione, effetto di filtro interno).

  • Fosforescenza e chemiluminescenza: principi di base ed applicazioni pratiche.

  • applicazioni biologiche delle tecniche fluorimetriche: localizzazione di fluorofori e studio di dinamiche di interazione molecolare sfruttando il fenomeno del quenching di fluorescenza (collisionale o dinamico e statico) costante di Stern-Volmer e determinazione del coefficiente di diffusione di un fluoroforo in soluzione.

  • trasferimento di energia per risonanza (FRET) : efficienza del trasferimento di energia, esempi di applicazione : studi di oligomerizzazione delle proteine, interazione proteina-acidi nucleici e proteina lipidi.

  • Fluorescenza in luce polarizzata: determinazione di anisotropia statica e dinamica: principi di base ed applicazioni allo studio delle proteine

 

6. tecniche di spettrocopia di assorbimento in luce polarizzata.

  • Dicroismo circolare: principi di base ed applicazioni per lo studio della struttura della proteine (determinazione del contenuto di alfa elica e foglietto beta). Principi di base del light-scattering e suo utilizzo per lo studio delle dimensioni di particelle (citofluorimetro).

 

7. applicazioni della spettrometria di massa allo studio di macromolecole biologiche.

 

  • Principi di base della spettroscopia di Massa: sorgente di ioni (Maldi, ESI), analizzatore di massa (TOF, analizzatore a quadrupolo).
  • Esempi di applicazione della massa per lo studio/identificazione di un polipeptide. Peptide mass fingerprinting.
  • Uso della spettroscopia di massa per la determinazione delle modificazioni indotte sulle proteine: grado di fosforilazione, alchilazione/acetilazione di residui aminoacidici, studio dell'interazione con farmaci ecc.
  • Determinazione della sequenza di proteine (sequenziamento di Edman e mediante spettrometria di massa).

8. Tecniche elettrochimiche.

  • Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori.


9. Metodi radioisotopici.

  • Principi, strumentazione ed applicazioni. Richiami sui tipi di decadimento radioattivo. Energia e velocità del decadimento radioattivo. Rivelazione e misura della radioattività. Efficienza di conteggio e quenching.
  • Autoradiografia. Applicazioni dei radioisotopi in biochimica: studio di vie metaboliche, studio di sistemi di trasporto e assorbimento, studi di legame. Applicazione dei radioisotopi nell'analisi clinica.

10. Tecniche immunochimiche.

  • Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali.
  • Metodi di analisi: reazione di immunoprecipitazione in fase libera ed in gel, immunodiffusione;
  • metodi radioimmunologici: RIA ed IRMA;
  • dosaggi immunoenzimatici: EMIT, ELISA e PEIA.

11. Tecniche di biologia molecolare.

  • Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali.
  • Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche, forensiche e paleobiologiche.
  • Sequenze VNTR: test di paternità. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche.
  • Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica. 
  • Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray.

12. Cenni sulla proteomica.


Testi/Bibliografia

K.Wilson e J.Walker -  Biochimica  e Biologia Molecolare: Principi e tecniche - Cortina Editore, 2006

Metodi didattici

Durante le lezioni verranno presentate le metodiche  connesse con la sperimentazione biochimica  negli aspetti sia strumentali sia applicativi. Per ogni tecnica verranno discussi esempi pratici.

Modalità di verifica dell'apprendimento

L'esame consiste in un colloquio orale su entrambi i moduli didattici, che non possono essere sostenuti in momenti di verifica separati fra loro.
L'esame di fine corso mira a verificare e valutare il raggiungimento degli obiettivi didattici:
- conoscere i principi di base delle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi di biomolecole;
- essere in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.
La durata della prova orale è mediamente di 30-45 minuti.
Il voto finale del Corso di Biochimica Applicata (Moduli I e II) viene definito, mediante una prova orale articolata su tre principali quesiti che verteranno su argomenti inerenti gli obiettivi del Corso. La valutazione della preparazione del candidato potrà avvalersi di ulteriori domande volte a specificare aspetti relativi ai tre quesiti principali.
Sarà oggetto di valutazione la capacità dello studente di sapersi muovere all'interno delle varie tecniche e applicazioni biochimiche. Il raggiungimento da parte dello studente di una visione organica dei temi affrontati a lezione congiunta alla loro utilizzazione critica, la dimostrazione del possesso di una padronanza espressiva e di linguaggio specifico saranno valutati con voti di eccellenza.

Strumenti a supporto della didattica

Videoproiettore, PC, Lavagna luminosa

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Romana Fato

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