99484 - STRUTTURISTICA BIOMOLECOLARE

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente possiede le conoscenze di base necessarie per la determinazione, a livello atomico/molecolare, della struttura di macromolecole biologiche mediante le tre tecniche principali quali la cristallografia di raggi X, la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) biomolecolare, e i metodi computazionali, e saprà valutare criticamente l’opportunità di utilizzo di queste tecniche. In particolare, lo studente è in grado i) di interpretare i risultati di un'indagine strutturale ai raggi X, ii) di sviluppare le competenze necessarie ad una lettura critica di articoli contenenti strutture cristallografiche di macromolecole biologiche, e iii) di applicare le principali tecniche di cristallizzazione di proteine anche attraverso attività pratiche. Lo studente ha inoltre acquisito familiarità con gli aspetti teorici e sperimentali della spettroscopia NMR, e in particolare conosce i) le basi fisiche e teoriche della spettroscopia NMR, ii) gli esperimenti NMR utilizzati per la determinazione della struttura e della dinamica di proteine, iii) gli approcci basati sulla spettroscopia NMR per lo studio delle interazioni intermolecolari. Al termine del corso lo studente ha inoltre acquisito conoscenze, tramite esercitazioni al computer, di tutti i passaggi necessari per la determinazione della struttura di una proteina in soluzione tramite la spettroscopia NMR. Lo studente ha inoltre acquisito conoscenze teoriche e pratiche sul calcolo della struttura e della dinamica di macromolecole e complessi macromolecolari tramite tecniche di chimica computazionale applicata a proteine e metallo-proteine.

Contenuti

Metodi computazionali (Prof. Francesco Musiani)

Introduzione (1 ora): Organizzazione delle lezioni e modalità di verifica dell'apprendimento. Introduzione agli argomenti del programma. Presentazione della strutturistica molecolare computazionale, dei suoi strumenti e dei suoi obiettivi.

Meccanica molecolare e campi di forza empirici (3 ore): Richiamo ai modelli atomici e al concetto di legame chimico. Sistemi di coordinate. Meccanica molecolare. Rappresentazione di atomi e molecole. Superfici di energia potenziale. Campi di forza empirici. Interazioni elettrostatiche. Interazioni intermolecolari. Forze di van der Waals. Polarizzabilità. Legami a idrogeno. Minimizzazione dell’energia.

Dinamica molecolare (teoria, 2 ore): Metodi per l’esplorazione della superficie di energia potenziale. Metodi di simulazione. Dinamica molecolare e cenni ai metodi per l’esplorazione accelerata della superficie di energia potenziale. Box di simulazione. Solvente implicito ed esplicito. Insiemi termodinamici. Termostato e pressostato.

Modellizzazione per omologia e riconoscimento molecolare (teoria, 2 ore): Principi della modellizzazione per omologia. Data base di sequenze proteiche. Allineamento di sequenze. Predizione della struttura proteica. Modellizzazione dei loop. Riconoscimento molecolare (docking) macromolecola - piccola molecola e macromolecola - macromolecola. Valutazione dei modelli.

Esercitazione di modellizzazione per omologia (4 ore): Introduzione al sistema operativo Linux. Richiami all’uso del programma di visualizzazione molecolare UCSF Chimera. Applicazione del programma Modeller per la modellizzazione di una metallo proteina. Ottimizzazione, valutazione e analisi del modello ottenuto.

Esercitazione di riconoscimento molecolare (4 ore): Utilizzo del programma DOCK e riconoscimento molecolare proteina - piccola molecola. Utilizzo del programma Haddock e riconoscimento molecolare proteina - proteina. Valutazione e analisi dei risultati.

Esercitazione di dinamica molecolare (4 ore): Utilizzo del programma GROMACS. Setup di un sistema di dinamica molecolare in solvente esplicito. Minimizzazione, equilibrazione del solvente e dinamica di produzione. Analisi dei risultati.

Biocristallografia (Dott. Luca Mazzei)

Introduzione (2 ore): organizzazione delle lezioni e modalità di verifica dell'apprendimento. Introduzione agli argomenti del programma. Presentazione della biocristallografia, dei suoi strumenti e dei suoi obiettivi.

Cristallizzazione di macromolecole biologiche (4 ore): principi termodinamici e cinetici del processo di cristallizzazione di macromolecole biologiche, processi di nucleazione e crescita cristallina, principali tecniche per la cristallizzazione di macromolecole biologiche.

Proprietà geometriche dei cristalli di macromolecole biologiche e basi fisiche della diffrazione di raggi X (6 ore): simmetrie presenti nei cristalli ed operazioni di simmetria consentite per molecole chirali, definizione e approfondimento del concetto di cella elementare e degli indici dei piani reticolari in un cristallo, caratteristiche dei raggi X e metodi per la loro produzione,

principi geometrici della diffrazione e legge di Bragg, tecniche di raccolta dei dati di diffrazione da cristalli proteici e caratteristiche dei dati raccolti, intensità e risoluzione.

Metodi di risoluzione strutturale di proteine tramite cristallografia a raggi X (6 ore): il fattore di struttura come somma di Fourier, trasformata di Fourier per ottenere la densità elettronica del campione cristallizzato, introduzione al problema della fase e metodi per la sua determinazione: sostituzione molecolare (molecular replacement, MR), sostituzione isomorfa (isomorphous replacement, IR), dispersione anomala (anomalous dispersion, SAD e MAD).

Ottenimento della struttura a raggi X finale e deposizione (2 ore): miglioramento delle fasi e raffinamento strutturale del modello cristallografico, validazione della struttura cristallografica e sua deposizione nel Protein Data Bank.

Il corso prevede una parte di esercitazione in laboratorio individuale (10 ore), suddivisa in tre esperienze, che consistono in: i) cristallizzazione del lisozima del bianco dell’uovo tramite diffusione di vapore, variando il tipo di precipitante e le concentrazioni di proteina, tampone e precipitante, ii) esame al microscopio dei cristalli ottenuti per valutarne la qualità e scelta dei campioni adatti all’indagine di diffrazione a raggi X, iii) raffinamento e modellizzazione della struttura a raggi X del lisozima a partire da dati sperimentali raccolti su un cristallo di lisozima e mediante l‘utilizzo di software specifici.

Spettroscopia NMR Biomolecolare (Prof. Stefano Ciurli):

Il corso prevede lo svolgimento di didattica frontale e di esercitazioni in laboratorio aventi lo scopo di mettere in pratica le basi teoriche della tecnica. Il syllabus prevede una lezione introduttiva (2 ore) di presentazione della spettroscopia NMR biomolecolare, dei suoi strumenti e dei suoi obiettivi. Di seguito saranno illustrate le basi fisiche della spettroscopia NMR ed i principi di funzionamento dello spettrometro NMR (6 ore). Le seguenti lezioni (30 ore) si svolgeranno utilizzando postazioni singole di PC per comprendere al meglio i) le procedure di processing del segnale NMR per l’ottenimento dello spettro NMR, ii) le informazioni chimico-strutturali che si derivano dallo spettro NMR di proteine, iii) le procedure di assegnamento dei segnali e iv) le procedure di calcolo della struttura e della dinamica di proteine in soluzione utilizzando la spettroscopia NMR.

 

 

Testi/Bibliografia

Gale Rhodes "Crystallography made crystal clear" III ed., Academic Press 2006

Alexander McPherson "Introduction to macromolecular crystallography" J. Wiley 2003

Bernhard Rupp “Biomolecular crystallography” Garland Science 2010

Ken Keeler “Understanding NMR Spectroscopy, Wiley, 2002

Bertini,McGreevy,Parigi "NMR of Biomolecules", Wiley.

Andrew L. Leach “Molecular modelling” Pearson Education 2001

 

 

Metodi didattici

Le lezioni saranno svolte in aula con uso di presentazioni multimediali e saranno completate da una parte di esercitazioni in laboratorio.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

Biocristallografia: l'esame finale consiste in un test contenente tre domande e problemi numerici ed in un eventuale colloquio orale. Almeno una delle tre domande verte su argomenti trattati durante l’esercitazione di laboratorio. Il risultato del test non preclude l'accesso all'orale ma sarà considerato nella valutazione del voto finale.

NMR: l'esame finale consiste in un test scritto contenente domande e problemi numerici per gli studenti che hanno presenziato a più del 90% delle ore totali previste; per coloro con una frequenza inferiore o uguale è previsto un colloquio e non un esame scritto.

Metodi computazionali: l’esame finale consiste in un colloquio orale per valutare la conoscenza dell'argomento da parte degli studenti. La prova orale sarà preceduta da una presentazione, in cui lo studente dovrà discutere un articolo scientifico inerente il programma del modulo e assegnato con largo anticipo e rispondere a domande inerenti la presentazione e il programma del modulo.

Strumenti a supporto della didattica

Files in formato pdf relativi al programma svolto disponibili nel sito web docente.

Esercitazioni di cristallizzazione di una proteina, scelta del campione più opportuno, raccolta dati di diffrazione ai raggi X ed utilizzo di un software di visualizzazione ed ottimizzazione del modello strutturale ottenuto

Esercitazioni su assegnamento sequenza-specifico di segnali di risonanza magnetica nucleare, processando ed analizzando dati di spettri NMR in tripla risonanza. Esercitazione sulla determinazione della struttura di una proteina usando dati NMR.

Esercitazioni su modellizzazione per omologia di una metallo proteina, riconoscimento molecolare proteina – piccola molecola e proteina – proteina, e valutazione della qualità di un modello molecolare. Esercitazione sulla preparazione di un sistema proteico per la dinamica molecolare, minimizzazione dell’energia, esecuzione di calcoli di dinamica molecolare ed analisi dei risultati

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Stefano Luciano Ciurli

Consulta il sito web di Luca Mazzei

Consulta il sito web di Francesco Musiani