Abstract
La neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è una malattia neurocutanea di predisposizione oncologica con un’incidenza alla nascita di 1:3500, causata da mutazioni inattivanti il gene NF1, che codifica per una proteina responsabile della regolazione negativa delle proteine Ras. Attualmente, circa il 10-15% dei pazienti che soddisfano i criteri clinici diagnostici per NF1 non riceve una conferma tramite i test genetici standard. Il tasso diagnostico può essere migliorato fino a oltre il 95% se si applicano tecniche complementari a livello dell’RNA, utili per identificare varianti introniche che generalmente non vengono rilevate con i test di routine. In questo contesto, il nostro obiettivo sarà migliorare la diagnosi molecolare: 1. Nei pazienti con test genetico standard negativo, combinando l’analisi RNA-seq per lo studio dei trascritti con il sequenziamento “long-read”, al fine di identificare riarrangiamenti strutturali (ampie delezioni/inserzioni, traslocazioni e trascritti di fusione); 2. Nei pazienti con NF1 segmentale, che presentano manifestazioni cliniche localizzate a uno o pochi segmenti corporei: in questi casi verranno analizzati diversi tessuti (tampone buccale e biopsie delle macchie "café-au-lait" o di neurofibromi multipli) e DNA libero circolante (cfDNA) nel plasma mediante ultra-deep amplicon sequencing, per rilevare varianti patogenetiche a basse frequenze. La principale causa di mortalità nei pazienti con NF1 è lo sviluppo del tumore maligno della guaina dei nervi periferici (MPNST), un sarcoma aggressivo dei tessuti molli, che origina in genere dal suo precursore benigno, il neurofibroma plessiforme (PN). La trasformazione da PN a MPNST è di difficile diagnosi a causa della difficoltà di interpretazione delle immagini radiologiche e dell’eterogeneità intralesionale, che può portare a errori di campionamento nelle biopsie. Sebbene studi precedenti abbiano identificato geni associati alla patogenesi del MPNST (come CDKN2, PRC2, TP53, BRAF), non è ancora chiaro quali siano gli eventi molecolari chiave che guidano l’evoluzione del MPNST a partire dal PN e che potrebbero essere monitorati come biomarcatori innovativi nel cfDNA plasmatico. In questo progetto verrà eseguito il sequenziamento dell’esoma (WES) su campioni bioptici somatici provenienti da PN e da MPNST dello stesso paziente al fine di identificare nuove mutazioni driver alla base della trasformazione maligna. Inoltre, considerando l’accumulo di varianti nei geni regolatori della cromatina verrà utilizzata una firma epigenetica diagnostica basata sulla metilazione del DNA per caratterizzare i diversi stadi tumorali e il grado di malignità. In una coorte aggiuntiva verranno raccolti campioni di plasma per valutare se le varianti genetiche associate alla trasformazione maligna possano essere rilevate anche nel cfDNA dello stesso paziente, configurando un possibile strumento di diagnosi personalizzata e monitoraggio precoce della malattia.
Risultati raggiunti
La neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è una malattia rara che può manifestarsi con macchie cutanee, neurofibromi, alterazioni oculari, difficoltà dello sviluppo e predisposizione alla comparsa di tumori. Per molte persone la diagnosi genetica arriva con i test tradizionali, ma esiste una quota di pazienti con diagnosi clinica e analisi genetiche non informative. Il progetto PRIN-PNRR è nato per rispondere a questa esigenza: usare tecnologie genomiche avanzate per migliorare la diagnosi, comprendere il rischio di trasformazione tumorale e costruire strumenti utili per il monitoraggio. Il lavoro ha coinvolto quattro Centri universitari: Bologna, Padova, Parma e Pavia, che hanno collaborato alla creazione di una rete integrata dedicata alla NF1. Sono stati raccolti dati clinici e campioni biologici, come sangue, cute, mucosa buccale, plasma e tessuti tumorali, da pazienti con forme classiche e sospette forme a mosaico, negativi all’analisi diagnostica standard. Attraverso il sequenziamento ad elevata profondità il progetto ha analizzato 70 pazienti precedentemente non risolti. Nel 29,6% dei casi è stata raggiunta una diagnosi molecolare definitiva; in un ulteriore 14,1% sono state identificate varianti candidate presenti a mosaico. Complessivamente, il 43,7% dei pazienti ha ottenuto una risposta diagnostica o un risultato fortemente indicativo. Il progetto ha, inoltre, fornito importanti informazioni anche sul ruolo del mosaicismo, situazione può rendere la diagnosi complessa poichè la variante può essere presente a livelli bassissimi nel sangue. L’utilizzo di campioni di tessuti diversi e di tecniche ad alta profondità ha dimostrato che il mosaicismo è una componente importante nelle forme di rimaste senza diagnosi, soprattutto nei pazienti con manifestazioni localizzate. Un altro elemento importante è stato l’uso dell’RNA per capire l’effetto reale di alcune varianti geniche: questo approccio ha permesso di confermare eventi anomali, come exon skipping, ritenzione di introni e attivazione di siti criptici di splicing, trasformando risultati incerti in informazioni utili per la diagnosi. La seconda grande area del progetto ha riguardato i tumori associati alla NF1. L’attenzione si è concentrata sui neurofibromi plessiformi, sulle lesioni atipiche intermedie, chiamate ANNUBP, e sui tumori maligni delle guaine dei nervi periferici, gli MPNST. Sono stati ottimizzati protocolli di sequenziamento dell’esoma su 25 campioni tumorali, anche da materiale difficile come tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. Le analisi hanno evidenziato alterazioni in geni e vie biologiche coerenti con la progressione tumorale, tra cui NF1, TP53, SUZ12, RB1, KIT e PDGFRA. I dati genomici hanno mostrato che la progressione verso la malignità non è un evento improvviso, ma un processo graduale. Per la prima volta dal punto di vista molecolare, si è definito che le lesioni ANNUBP presentano caratteristiche intermedie tra i tumori benigni e gli MPNST, mentre questi ultimi, soprattutto nelle forme metastatiche, mostrano maggiore instabilità genomica e accumulo di alterazioni strutturali. Questo risultato rafforza l’idea di un continuum biologico dalla lesione precursore al tumore aggressivo e apre la strada a marcatori precoci di trasformazione così da poter monitorare i pazienti. Il progetto ha sviluppato, inoltre, nuovi approcci di “biopsia liquida”, cioè analisi del DNA libero circolante nel plasma derivato dai campioni di sangue. Sono stati studiati 48 campioni di plasma da pazienti con diverse condizioni tumorali o post-operatorie. L’analisi dei frammenti di DNA circolante ha mostrato segnali diversi in base al tipo di tumore e allo stato di malattia: gli MPNST (sarcomi della guina mielinica) e i GIST (tumori gastrointestinali stromali) attivi hanno mostrato i profili più marcati, mentre i controlli benigni hanno presentato segnali genomici tumorali più deboli. In futuro un prelievo di sangue potrebbe contribuire a monitorare la malattia e intercettare segnali precoci di trasformazione o di riattivazione di malattia come all’inizio della fase metastatica. Infine, le analisi epigenetiche, basate sullo studio della metilazione del DNA, hanno permesso di distinguere diverse identità tumorali e di confermare che le lesioni ANNUBP occupano uno stato intermedio tra benignità e malignità, ma che possono identificare già profili avanzati che a livello istologico standard non si riescono ancora a rilevare. Il progetto ha permesso pertanto l’integrazione di genomica, trascrittomica, epigenomica e analisi del DNA circolante come percorso fondamentale per l’approccio ad una malattia così complessa dal punto di vista dell’eterogeneità clinica dei pazienti che possa permettere una miglior definizione del rischio di trasformazione o progressione tumorale e che permetta di ottenere una diagnosi genetica definitiva. Questa piattaforma multi-omica avanzata che è stata generata e resa disponibile ai pazienti permetterà di migliorare la diagnosi dei casi irrisolti, descrivere la progressione tumorale e porre le basi per una medicina personalizzata per le persone con NF1.Project details
Unibo Team Leader: Alessandro Vaisfeld
Unibo involved Department/s:
Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche
Coordinator:
Università degli Studi di PAVIA(Italy)
Total Unibo Contribution: Euro (EUR) 5.860,00
Project Duration in months: 24
Start Date:
30/11/2023
End Date:
28/02/2026
