Abstract
I metodi convenzionali per la diagnosi di diversi tipi di cancro, tra cui il cancro ovarico (OC), si basano su metodi invasivi e dolorosi che non sono adatti per uno screening frequente, il quale è tuttavia cruciale per una diagnosi precoce e per aumentare le possibilità di sopravvivenza. Pertanto, è urgente lo sviluppo di biosensori sensibili, portatili, a basso costo e facili da usare per la rivelazione non invasiva di biomarcatori specifici nei fluidi biologici, al fine di consentire uno screening frequente di una grande parte della popolazione per diagnosticare precocemente il tumore e intervenire tempestivamente. I microRNA (miRNA) sono candidati promettenti come marcatori diagnostici per i tumori, poiché il loro profilo di espressione cambia significativamente già nelle fasi iniziali della malattia. Ad esempio, diversi miRNA specifici sono espressi in modo anomalo nel cancro ovarico e rappresentano ideali biomarcatori diagnostici basati sul sangue. Inoltre, il significato diagnostico della misurazione dei livelli di miRNA aumenta notevolmente quando le informazioni singole vengono combinate. Il progetto si propone di sviluppare un biosensore portatile e a basso costo per la quantificazione simultanea di diversi miRNA specifici per il cancro ovarico nel sangue capillare, combinando il semplice e facile da usare test di flusso laterale degli acidi nucleici (NALFA) con la rilevazione ottica (visiva-colorimetrica e chemiluminescente) e sfruttando la misurazione e l'elaborazione del segnale basata su smartphone. Il nuovo biosensore si baserà sulla tecnica LFA, che consiste nell'uso di una membrana porosa di nitrocellulosa in cui sono immobilizzate sonde specifiche per il riconoscimento degli analiti bersaglio in zone spazialmente confinate (zone di test). Mentre pochi microlitri di campione di sangue scorrono attraverso la striscia, ogni miRNA bersaglio verrà catturato da una sonda di cattura del DNA specifico e poi rivelato mediante ibridazione con una seconda sonda di DNA opportunamente marcata per la rivelazione ottica. I segnali colorimetrici o chemiluminescenti verranno misurati utilizzando la fotocamera di uno smartphone e le immagini digitali verranno elaborate utilizzando un'applicazione ad hoc per raggiungere una misurazione quantitativa. Il dispositivo comprenderà una cartuccia che ospita la striscia LFA e i reagenti necessari per il test chemiluminescente, e un adattatore per smartphone che crea una "mini scatola oscura" e assicura la corretta posizione della striscia davanti alla fotocamera. Tutti gli accessori saranno prodotti sfruttando la tecnologia di stampa 3D. L'applicazione sviluppata verrà utilizzata anche per combinare informazioni quantitative sugli analiti bersaglio, fornendo un punteggio che potrebbe rappresentare un allarme per indirizzare verso una diagnosi di conferma. Lo sviluppo di test minimamente invasivi per la diagnosi precoce del cancro ovarico potrebbe rappresentare una svolta nella lotta contro questa malattia, consentendo uno screening su larga scala a basso costo e potrebbe rappresentare un prototipo per lo sviluppo di una nuova generazione di biosensori miRNA multiplex, sfruttando la stessa strategia per la diagnosi precoce e sensibile di altri tumori.
Results achieved
The project successfully achieved its primary objective of developing an innovative, portable and low-cost biosensor for the detection and quantification of ovarian cancer (OC)-specific miRNAs in capillary blood. The integration of nucleic acid lateral flow assay (NALFA) technology with optical detection strategies, including both colorimetric and chemiluminescent (CL) approaches, was effectively demonstrated, enabling sensitive and user-friendly point-of-care testing. Highly predictive miRNA targets associated with ovarian cancer were first identified, and specific DNA capture and detection probes were designed and optimized to ensure high specificity and minimal cross-reactivity. Subsequently, the lateral flow assay platform was developed and optimized through the selection of suitable materials, assay conditions, and signal acquisition protocols, leading to robust analytical performance. The project also achieved the development and validation of both colorimetric and chemiluminescent LFA methods, demonstrating improved sensitivity and enabling quantitative analysis. Overall, the developed platform represents a significant advancement in point-of-care diagnostics and provides a versatile technological framework for future applications in multiplex biomarker detection and precision medicine. The project's objectives were achieved through the development of an NALFA platform for the simultaneous detection of microRNA biomarkers, integrating a dual-detection strategy based on gold nanoparticles (AuNPs) for colorimetric detection and horseradish peroxidase (HRP) for chemiluminescent detection. This approach enabled both visual signal generation and enhanced analytical sensitivity. The analytical performance of the colorimetric assay was evaluated through calibration studies under optimized conditions. The miR-215 detection system demonstrated higher analytical sensitivity, with a limit of detection (LOD) of 0.05 nM, while the miR-21 assay achieved an LOD of 0.5 nM. Dynamic quantification ranges of 0.5–7 nM and 2–14 nM were obtained for miR-215 and miR-21, respectively. The integration of chemiluminescence further improved assay sensitivity. In particular, miR-21 was successfully quantified down to an LOD of 0.02 nM, with a dynamic range between 0.05 and 10 nM. The enhanced sensitivity derives from the HRP-catalyzed chemiluminescent reaction, which amplifies the analytical signal and, when coupled with a highly sensitive photon detector, outperforms conventional colorimetric detection. Preliminary results obtained for miR-215 confirm the same trend. The selectivity of both assays was investigated through cross-reactivity studies using synthetic miRNA analogues containing defined sequence mismatches. The miR-21 assay exhibited excellent selectivity, with cross-reactivity values below 3.2% for all tested analogues. In contrast, the miR-215 assay showed mismatch position-dependent behavior, with cross-reactivity values ranging from negligible (0.2–4.6%) to higher values (10.7–40.9%). One analogue (CR215_2) displayed unexpectedly high apparent cross-reactivity (257.1%), likely due to stronger hybridization affinity than the target sequence. Further optimization of the probe lengths, particularly that of the AuNP-HRP-labelled probe, significantly improved assay selectivity and minimized cross-reactivity. The applicability of the assay to biological matrices was evaluated using human serum samples spiked with target miRNAs. Although an initial matrix effect caused inhibition of the analytical signal, the addition of 5% DCEP as an RNase inhibitor completely restored signal recovery after 30 minutes of incubation, demonstrating the feasibility of the method for complex biological samples. Chemiluminescence measurements were initially performed using a CCD detector to optimize the method under robust and reproducible laboratory conditions. Subsequently, the protocol was successfully transferred to smartphone-based detection. Dedicated applications, together with a custom optical adapter and a light-shielding enclosure, enabled long-exposure image acquisition under controlled dark conditions, allowing reliable signal quantification with a portable, low-cost device suitable for point-of-care applications.Project details
Unibo Team Leader: Martina Zangheri
Unibo involved Department/s:
Dipartimento di Chimica "Giacomo Ciamician"
Coordinator:
Università degli Studi di TORINO(Italy)
Total Unibo Contribution: Euro (EUR) 92.000,00
Project Duration in months: 24
Start Date:
28/09/2023
End Date:
28/02/2026
