A Sviluppo dicomposti biologicamente attivi
I.
Caratterizzazione del meccanismo d'azione di composti di interesse
farmaceutico, cosmetico, nutraceutico e studio dell'interazione ligando-proteina target
(tumore, malattia di Alzheimer, enfisema polmonare, etc.) e
ligando-proteine di trasporto (HSA e AGP), tramite dicroismo
circolare, fluorescenza e altri metodi spettroscopici e
cromatografici (HPLC accoppiata alla spettrometria di massa e al
detector CD).
II.
Sviluppo di metodi cromatografici (HPLC) e spettrometria di massa
(ion trap, QTOF, MALDI-TOF) per studi di proteomica e di
caratterizzazione e analisi di biomarkers di interesse
farmaceutico.
III.
Sviluppo di micro-bioreattori con enzimi immobilizzati per lo
screening automatico ad alta produttività di inibitori e/o
substrati, tramite sistemi HPLC-accoppiati a spettrometria di massa
e/o rivelatori spettroscopici.
IV.
Modulazione di transizioni conformazionali di peptidi: processo di
aggregazione di peptidi amiloidei.
V.
Caratterizzazione stereochimica di farmaci chirali.
B) Sviluppo di metodi analitici per farmaci e composti ad essi
correlati in matrici complesse (formulazioni farmaceutiche,
cosmetici, prodotti vegetali, campioni biologici) tramite tecniche
combinate: cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di
massa (HPLC-MS), gas cromatografia (GC-MS),cromatografia liquida
accoppiata al rivelatore a fotodiodi (HPLC-DAD), cromatografia
liquida accoppiata al dicroismo circolare, UPLC (ultra-pressure
liquid chromatography).
Studi di
stabilità e fotostabilità di farmaci e composti attivi. Convalida
di metodi analitici.
A1. Metodologie analitiche innovative nella scoperta di nuovi
farmaci; L'obiettivo di questa prima parte è lo sviluppo di
metodi analitici rapidi per la selezione di potenziali farmaci di
provenienza sintetica e naturale per il trattamento della malattia
di Alzheimer (AD), il cancro e l'obesità.
La natura multifattoriale della eziopatologia di AD rende
difficile la scoperta di terapie efficaci per il suo trattamento.
AD è un disordine neurodegenerativo correlato all'età,
caratterizzato clinicamente da perdita di memoria, e progressiva
alterazione funzionale dei distretti cognitivi. Molti sforzi sono
stati rivolti a chiarire i rapporti fra i vari elementi
fisiopatologici della malattia ovvero: (i) le placche di
amiloide-β (Aβ), depositi del peptide
β-amiloide generato dall'azione di
β-secretasi (BACE-1) e γ-secretasi sulla
Proteina Precursore dell'Amiloide (APP) ii) grovigli
neurofibrillari della proteina tau iperfosforilata e iii) perdita
di neuroni nell'ippocampo e nel nucleo basale di Maynart. AD è
caratterizzato da una pronunciata degradazione del sistema
colinergico e da alterazione dei sistemi di neurotrasmissione
glutammatergico e serotoninergico.
Per risolvere questo problema, è stato recentemente proposto
l'uso di ligandi diretti a più bersagli molecolari (Multi-targets
Direct Ligands, MTDLs), in grado di colpire simultaneamente i
diversi punti cruciali dello sviluppo di AD. Quindi un programma di
ricerca più mirato e con maggiori garanzie di successo punta ad
identificare nuovi MTDLs in grado di agire su target rilevanti per
l'AD, come AChE, la produzione e l'aggregazione di Aβ e lo
stress ossidativo.
Sulla base di queste premesse, BACE-1, l'enzima coinvolto nella
produzione di Aβ, BChE (butirrilcolinesterasi or
pseudocolinesterasi) che da recenti pubblicazioni sembra possa
sostituire AChE come enzima coinvolto nella degradazione
dell'acetilcolina nei pazienti con AD di livello moderato, e
l'aggregazione amiloidea saranno i target su cui si focalizzerà
questo progetto per la selezione di MTDLs come potenziali farmaci
per il trattamento di questa patologia.
Il progetto mira ad ottimizzare sistemi HPLC in cui sono stati
inseriti IMERs (reattori a base di enzima immobilizzato),
accoppiati con rivelazione spettroscopica, elettrochimica o
analizzatori di massa, per la selezione rapida di nuovi inibitori
come potenziali farmaci per AD.
A seguito di precedenti studi su AChE, gli IMERs saranno usati
per approfondire le conoscenze sulle proprietà dei potenti
inibitori precedentemente selezionati, incluso la caratterizzazione
qualitativa del meccanismo d'azione (i.e. competitivo, non
competitivo, etc.) e la valutazione quantitativa delle costanti di
inibizione (Ki). Questi nuovi sistemi permetteranno quindi di usare
i target selezionati per caratterizzare nuovi potenti
inibitori.
La preparazione e la caratterizzazione degli IMERs prevede tre
fasi: (i) l'immobilizzazione dell'enzima target, (ii) la verifica
che la funzione enzimatica non è stata alterata dal processo di
immobilizzazione e (iii) la determinazione dei parametri di legame
dei ligandi in seguito all' inserimento dell'IMER in un sistema
HPLC. Riguardo a BChE e BACE-1, la loro immobilizzazione verrà
condotta tramite una procedura in-situ su dischi di
dimensioni millimetriche a base di matrici monolitiche a
funzionalità etilendiamminica (EDA-CIM). L'attività e i parametri
cinetici dei micro-IMERs saranno verificati dopo il loro
inserimento in un sistema HPLC con rivelazione UV, fluorimetrica o
di massa.
Per il BACE-1 micro-IMER verranno determinate le unità di enzima
immobilizzato e verranno ottimizzate le condizioni cromatografiche,
tra cui la composizione della fase mobile, per esaltarne
l'attività, utilizzando come substrato Caseina-FITC e JMV2236, un
peptide che mima la sequenza della APP mutata svedese.
Nel caso invece di BChE micro-IMER, la butirriltiocolina sarà
usata come substrato. La butirriltiocolina iniettata nel sistema
HPLC, verrà idrolizzato dall'enzima immobilizzato formando
tiocolina. Quest'ultima in presenza del reattivo di Ellman nella
fase mobile formerà un prodotto rivelabile colorato.
Gli studi di inibizione saranno condotti iniettando
simultaneamente il substrato e i composti da testare. La relativa
IC50 sarà ottenuto valutando la riduzione percentuale dell'area del
picco del prodotto dell'idrolisi catalizzata dall'enzima in
funzione della concentrazione dell'inibitore.
Riguardo allo sviluppo di efficienti metodologie per la
selezione di potenziali farmaci nel trattamento dei tumori, di
recente è stato registrato un interesse crescente per l'enzima
istone deacetilasi (HDACs) a seguito dell'abilità che hanno
mostrato gli inibitori di HDACs di arrestare la crescita di cellule
tumorali in vitro e nell'animale a dosi poco tossiche. Inibitori
delle HDACs quali acidi a corta catena come il butirrato e il
valproato e acidi idrossamici come la tricostatina A sono stati
descritti come potenziali farmaci antitumorali in una varietà di
studi preclinici. Infatti, il trattamento di cellule con
questi inibitori produce un incremento di forme istoniche altamente
acetilate che influenzano l'espressione genica, il differenziamento
e l'apoptosi cellulare.
Sono perciò richieste metodologie analitiche per la
determinazione dell'attività di nuovi inibitori delle HDACs al fine
di selezionare nuovi candidati antitumorali attivi in sistemi
biologici più complessi. A questo riguardo è stato recentemente
sviluppato un metodo HPLC-ESI-MS per determinare le proteine
istoniche intatte dopo estrazione dai nuclei di cellule del tumore
al colon HT29.Tuttavia, oltre al livello di acetilazione delle
proteine istoniche, risulta essere di critica importanza la
determinazione dei specifici amminoacidi coinvolti
nell'acetilazione per poter correlare le modifiche istoniche
post-traduzionali all'evoluzione del ciclo cellulare. Verrà
ottimizzato un metodo HPLC-ESI-MS/MS, comprendente un IMER a base
di tripsina, per analizzare la mappa triptica e i siti di
acetilazione delle proteine istoniche dopo inibizione della
HDACs.
In questo ambito, verranno effettuati esperimenti di
elettroforesi capillare (CE). In particolare, saranno preparati
nuovi capillari permanentemente modificati in grado di ridurre
l'adsorbimento di proteine e il flusso elettrosmotico. Le procedure
di rivestimento con diversi polimeri (idrossipropilmetil cellulosa
e alcoli polivinilici) verranno ottimizzate al fine di ottenere
separazioni altamente efficienti degli istoni.
Relativamente alla importante attività biologica recentemente
descritta per i costituenti lipofili (alcammidie poliacetileni) di
Echinacea, verranno ottimizzati e convalidati metodi HPLC e
CE per la separazione, identificazione e dosaggio di questi
composti in matrici complesse, come parti di piante, estratti e
prodotti naturali. Riguardo alle specie Ephedra e
Citrus, verranno sviluppati metodi senza l'uso della coppia
ionica, completamente convalidati, semplici, veloci e affidabili
per l'analisi di alcaloidi di Ephedra e Citrus, al
fine di garantire la qualità e la sicurezza dei prodotti
commerciali. Nel caso dell'Ephedra, i metodi convalidati
saranno applicati al controllo di qualità delle parti della pianta
e degli estratti per determinare la composizione dei prodotti
commerciali, verificare le dichiarazioni in etichetta, includendo
l'assenza di alcaloidi dell'efedrina nei prodotti
Ephedra-free. Siccome gli alcaloidi di Ephedra e
Citrus sono composti chirali, saranno sviluppate tecniche
enantioselettive per separare e dosare gli enantiomeri e per
valutare la loro distribuzione negli estratti grezzi e nei prodotti
naturali.
A2. Metodologie analitiche innovative negli studi di
somministrazione, distribuzione, metabolismo (ADME). I composti
attivi selezionati da A1 saranno caratterizzati rispetto alla loro
affinità per le proteine del plasma (albumina; HSA, e alfa1
acido-glicoproteina, AGP) tramite metodologie biocromatografiche e
con il biosensore ottico. Le proteine saranno legate alla matrice
silicea monolitica o alla superficie del chip del biosensore. Verrà
selezionata la procedura che meglio garantisce il mantenimento,
dopo immobilizzazione, delle proprietà di legame della proteina in
soluzione. Perciò le varie classi di composti saranno analizzate e
selezionate rispetto alla loro frazione legata e verranno
determinati i parametri di legame (KA, ka, kd). In particolare,
l'uso del biosensore ottico risulta ottimale nella determinazione
dei parametri cinetici. Questo aspetto è particolarmente importante
nei criteri di selezione dei composti perchè la cinetica di legame
influenza la distribuzione del farmaco. Un'ulteriore
caratterizzazione dei parametri di distribuzione di potenziali
farmaci sarà ottenuta studiando i siti di legame dei farmaci sulla
proteina di trasporto tramite esperimenti di spiazzamento con
marcatori selettivi dei singoli siti. Queste informazioni
permetteranno di definire i siti di legame per ogni classe di
composti e di valutare possibili interazioni con metaboliti e
potenziali farmaci co-somministrati. L'interazione fra farmaci
rappresenta, infatti, un aspetto cruciale che può determinare un
cambiamento della frazione libera del farmaco e quindi della sua
attività e tossicità. Un approccio alternativo alla proteina
immobilizzata su fase stazionaria cromatografica è l'uso dell'HSA
come fase pseudostazionaria in elettroforesi capillare per ottenere
informazioni sulle interazioni farmaco-proteina e farmaco-farmaco.
La fase I del progetto riguarderà lo sviluppo delle procedure di
immobilizzazione delle proteine su matrice silicea e su superfici
specifiche del biosensore, mentre la fase II riguarderà
l'applicazione dei sistemi ottenuti allo studio del legame e dei
parametri di distribuzione dei composti studiati.
A3. Metodologie analitiche innovative nel controllo di
qualità, pre-formulazione e formulazione.
La determinazione di impurezze di farmaci in matrici complesse
richiede metodi analitici rapidi e selettivi; in questo ambito,
tecniche elettrocinetiche verranno utilizzate per sviluppare metodi
selettivi ed enantioselettivi per l'analisi di farmaci di sintesi e
da estratti di piante. Sistemi elettrocinetici basati su fasi
pseudostazionarie doppie (ciclodestrine e tensioattivi ionici) e/o
microemulsioni, verranno inizialmente caratterizzati dal punto di
vista chimico-fisico. A questo scopo, misure in elettroforesi
capillare (CE) saranno volte alla valutazione della forza di legame
nell'interazione fra tensioattivi e ciclodestrine e le informazioni
così ottenute verranno integrate con i risultati ricavati
dall'applicazione di altre tecniche chimico-fisiche indipendenti
(dynamic light scattering e spettroscopia di risonanza
paramagnetica). In particolare, deve essere tenuta in
considerazione l'entità dell'interazione e la stechiometria del
complesso fra ciclodestrine e tensioattivi, che agiscono come
componenti della fase pseudostazionaria in CE, per poter chiarire i
meccanismi del processo di separazione Successivamente,
l'applicazione dei sistemi così caratterizzati sarà diretta alla
determinazione di biomarcatori vegetali in una serie di estratti di
piante anche di uso alimentare. Precisamente, ( -)-catechina e (
-)-gallocatechina sono stati individuati quali utili biomarcatori
nel processo di degradazione in estratti di piante in quanto la
loro presenza nel campione è esclusivamente correlata alla
epimerizzazione di ( -)-epicatechina e ( -)-epigallocatechina, due
metaboliti secondari fra i più diffusi nel regno vegetale. Poiché
la cinetica di epimerizzazione si è dimostrata particolarmente
veloce, la presenza di questi composti esogeni in alimenti ed
estratti di piante può essere considerata una importante evidenza
della avvenuta degradazione del prodotto. Inoltre, studi recenti
hanno dimostrato che ( -)-catechina possiede una minore
biodisponibilità rispetto alla ( +)-catechina naturale [49]. Per
questi motivi, la determinazione di tali biomarcatori verrà
proposta come un utile ausilio per la valutazione della qualità di
alimenti ed estratti vegetali così come sarà sfruttato per
acquisire informazioni riguardanti i processi produttivi
manifatturieri a cui sono sottoposti e per assicurare la conformità
dei prodotti ottenuti con le leggi vigenti. La convalida dei metodi
sviluppati così come la fase di elaborazione dei dati ottenuti in
fase applicativa, saranno condotte mediante approccio chemometrico
.
