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Vincenza Andrisano

Professoressa ordinaria

Dipartimento di Scienze per la Qualità della Vita

Settore scientifico disciplinare: CHIM/08 CHIMICA FARMACEUTICA

Coordinatrice del Corso di Laurea Magistrale a ciclo unico in Farmacia

Coordinatrice del Corso di Laurea in Controllo di qualità dei prodotti per la salute

Temi di ricerca

Parole chiave: Sviluppo di metodi analitici per il dosaggio di farmaci e composti ad essi correlati in matrici complesse (formulazioni, cosmetici, prodotti natrurali, campioni biologici) IMMOBILIZZAZIONE di ENZIMI per caratterizzazione di substrati e inibitori Stabilità e fotostabilità di farmaci e composti biologicamente attivi UPLC (ultra-pressure liquid chromatography) per analisi veloci di composti biologicamente attivi Metabolismo di farmaci e composti biologicamente attivi Cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (HPLC-ESI-MS) DICROISMO CIRCOLARE nella determazione della struttura secondaria di proteine BIOCROMATOGRAFIA per lo studio di interazioni ligando proteina bersaglio ANALISI FARMACEUTICA Studi di proteomica del nucleo di cellule tumorali

         

A Sviluppo dicomposti biologicamente attivi

 I.                    Caratterizzazione del meccanismo d'azione di composti di interesse farmaceutico, cosmetico, nutraceutico e studio dell'interazione ligando-proteina target (tumore, malattia di Alzheimer, enfisema polmonare, etc.) e ligando-proteine di trasporto (HSA e AGP), tramite dicroismo circolare, fluorescenza e altri metodi spettroscopici e cromatografici (HPLC accoppiata alla spettrometria di massa e al detector CD).

          II.                    Sviluppo di metodi cromatografici (HPLC) e spettrometria di massa (ion trap, QTOF, MALDI-TOF) per studi di proteomica e di caratterizzazione e analisi di biomarkers di interesse farmaceutico.

        III.                    Sviluppo di micro-bioreattori con enzimi immobilizzati per lo screening automatico ad alta produttività di inibitori e/o substrati, tramite sistemi HPLC-accoppiati a spettrometria di massa e/o rivelatori spettroscopici.

        IV.                    Modulazione di transizioni conformazionali di peptidi: processo di aggregazione di peptidi amiloidei.

          V.                    Caratterizzazione stereochimica di farmaci chirali.

 

B) Sviluppo di metodi analitici per farmaci e composti ad essi correlati in matrici complesse (formulazioni farmaceutiche, cosmetici, prodotti vegetali, campioni biologici) tramite tecniche combinate: cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (HPLC-MS), gas cromatografia (GC-MS),cromatografia liquida accoppiata al rivelatore a fotodiodi (HPLC-DAD), cromatografia liquida accoppiata al dicroismo circolare, UPLC (ultra-pressure liquid chromatography).

         Studi di stabilità e fotostabilità di farmaci e composti attivi. Convalida di metodi analitici.



A1. Metodologie analitiche innovative nella scoperta di nuovi farmaci; L'obiettivo di questa prima parte è lo sviluppo di metodi analitici rapidi per la selezione di potenziali farmaci di provenienza sintetica e naturale per il trattamento della malattia di Alzheimer (AD), il cancro e l'obesità.

La natura multifattoriale della eziopatologia di AD rende difficile la scoperta di terapie efficaci per il suo trattamento. AD è un disordine neurodegenerativo correlato all'età, caratterizzato clinicamente da perdita di memoria, e progressiva alterazione funzionale dei distretti cognitivi. Molti sforzi sono stati rivolti a chiarire i rapporti fra i vari elementi fisiopatologici della malattia ovvero: (i) le placche di amiloide-β (Aβ), depositi del peptide β-amiloide generato dall'azione di  β-secretasi  (BACE-1) e γ-secretasi sulla Proteina Precursore dell'Amiloide (APP) ii) grovigli neurofibrillari della proteina tau iperfosforilata e iii) perdita di neuroni nell'ippocampo e nel nucleo basale di Maynart. AD è caratterizzato da una pronunciata degradazione del sistema colinergico e da alterazione dei sistemi di neurotrasmissione glutammatergico e serotoninergico.

Per risolvere questo problema, è stato recentemente proposto l'uso di ligandi diretti a più bersagli molecolari (Multi-targets Direct Ligands, MTDLs), in grado di colpire simultaneamente i diversi punti cruciali dello sviluppo di AD. Quindi un programma di ricerca più mirato e con maggiori garanzie di successo punta ad identificare nuovi MTDLs in grado di agire su target rilevanti per l'AD, come AChE, la produzione e l'aggregazione di Aβ e lo stress ossidativo.

Sulla base di queste premesse, BACE-1, l'enzima coinvolto nella produzione di Aβ, BChE (butirrilcolinesterasi or pseudocolinesterasi) che da recenti pubblicazioni sembra possa sostituire AChE come enzima coinvolto nella degradazione dell'acetilcolina nei pazienti con AD di livello moderato, e l'aggregazione amiloidea saranno i target su cui si focalizzerà questo progetto per la selezione di MTDLs come potenziali farmaci per il trattamento di questa patologia.

Il progetto mira ad ottimizzare sistemi HPLC in cui sono stati inseriti IMERs (reattori a base di enzima immobilizzato), accoppiati con rivelazione spettroscopica, elettrochimica o analizzatori di massa, per la selezione rapida di nuovi inibitori come potenziali farmaci per AD.

A seguito di precedenti studi su AChE, gli IMERs saranno usati per approfondire le conoscenze sulle proprietà dei potenti inibitori precedentemente selezionati, incluso la caratterizzazione qualitativa del meccanismo d'azione (i.e. competitivo, non competitivo, etc.) e la valutazione quantitativa delle costanti di inibizione (Ki). Questi nuovi sistemi permetteranno quindi di usare i target selezionati per caratterizzare nuovi potenti inibitori.

La preparazione e la caratterizzazione degli IMERs prevede tre fasi: (i) l'immobilizzazione dell'enzima target, (ii) la verifica che la funzione enzimatica non è stata alterata dal processo di immobilizzazione e (iii) la determinazione dei parametri di legame dei ligandi in seguito all' inserimento dell'IMER in un sistema HPLC. Riguardo a BChE e BACE-1, la loro immobilizzazione verrà condotta tramite una procedura in-situ su dischi di dimensioni millimetriche a base di matrici monolitiche a funzionalità etilendiamminica (EDA-CIM). L'attività e i parametri cinetici dei micro-IMERs saranno verificati dopo il loro inserimento in un sistema HPLC con rivelazione UV, fluorimetrica o di massa.

Per il BACE-1 micro-IMER verranno determinate le unità di enzima immobilizzato e verranno ottimizzate le condizioni cromatografiche, tra cui la composizione della fase mobile, per esaltarne l'attività, utilizzando come substrato Caseina-FITC e JMV2236, un peptide che mima la sequenza della APP mutata svedese.

Nel caso invece di BChE micro-IMER, la butirriltiocolina sarà usata come substrato. La butirriltiocolina iniettata nel sistema HPLC, verrà idrolizzato dall'enzima immobilizzato formando tiocolina. Quest'ultima in presenza del reattivo di Ellman nella fase mobile formerà un prodotto rivelabile colorato.

Gli studi di inibizione saranno condotti iniettando simultaneamente il substrato e i composti da testare. La relativa IC50 sarà ottenuto valutando la riduzione percentuale dell'area del picco del prodotto dell'idrolisi catalizzata dall'enzima in funzione della concentrazione dell'inibitore.

 

Riguardo allo sviluppo di efficienti metodologie per la selezione di potenziali farmaci nel trattamento dei tumori, di recente è stato registrato un interesse crescente per l'enzima istone deacetilasi (HDACs) a seguito dell'abilità che hanno mostrato gli inibitori di HDACs di arrestare la crescita di cellule tumorali in vitro e nell'animale a dosi poco tossiche. Inibitori delle HDACs quali acidi a corta catena come il butirrato e il valproato e acidi idrossamici come la tricostatina A sono stati descritti come potenziali farmaci antitumorali in una varietà di studi preclinici.  Infatti, il trattamento di cellule con questi inibitori produce un incremento di forme istoniche altamente acetilate che influenzano l'espressione genica, il differenziamento e l'apoptosi cellulare.

Sono perciò richieste metodologie analitiche per la determinazione dell'attività di nuovi inibitori delle HDACs al fine di selezionare nuovi candidati antitumorali attivi in sistemi biologici più complessi. A questo riguardo è stato recentemente sviluppato un metodo HPLC-ESI-MS per determinare le proteine istoniche intatte dopo estrazione dai nuclei di cellule del tumore al colon HT29.Tuttavia, oltre al livello di acetilazione delle proteine istoniche, risulta essere di critica importanza la determinazione dei specifici amminoacidi coinvolti nell'acetilazione per poter correlare le modifiche istoniche post-traduzionali all'evoluzione del ciclo cellulare. Verrà ottimizzato un metodo HPLC-ESI-MS/MS, comprendente un IMER a base di tripsina, per analizzare la mappa triptica e i siti di acetilazione delle proteine istoniche dopo inibizione della HDACs.

In questo ambito, verranno effettuati esperimenti di elettroforesi capillare (CE). In particolare, saranno preparati nuovi capillari permanentemente modificati in grado di ridurre l'adsorbimento di proteine e il flusso elettrosmotico. Le procedure di rivestimento con diversi polimeri (idrossipropilmetil cellulosa e alcoli polivinilici) verranno ottimizzate al fine di ottenere separazioni altamente efficienti degli istoni.

 

Relativamente alla importante attività biologica recentemente descritta per i costituenti lipofili (alcammidie poliacetileni) di Echinacea, verranno ottimizzati e convalidati metodi HPLC e CE per la separazione, identificazione e dosaggio di questi composti in matrici complesse, come parti di piante, estratti e prodotti naturali. Riguardo alle specie Ephedra e Citrus, verranno sviluppati metodi senza l'uso della coppia ionica, completamente convalidati, semplici, veloci e affidabili per l'analisi di alcaloidi di Ephedra e Citrus, al fine di garantire la qualità e la sicurezza dei prodotti commerciali. Nel caso dell'Ephedra, i metodi convalidati saranno applicati al controllo di qualità delle parti della pianta e degli estratti per determinare la composizione dei prodotti commerciali, verificare le dichiarazioni in etichetta, includendo l'assenza di alcaloidi dell'efedrina nei prodotti Ephedra-free. Siccome gli alcaloidi di Ephedra e Citrus sono composti chirali, saranno sviluppate tecniche enantioselettive per separare e dosare gli enantiomeri e per valutare la loro distribuzione negli estratti grezzi e nei prodotti naturali.

A2. Metodologie analitiche innovative negli studi di somministrazione, distribuzione, metabolismo (ADME). I composti attivi selezionati da A1 saranno caratterizzati rispetto alla loro affinità per le proteine del plasma (albumina; HSA, e alfa1 acido-glicoproteina, AGP) tramite metodologie biocromatografiche e con il biosensore ottico. Le proteine saranno legate alla matrice silicea monolitica o alla superficie del chip del biosensore. Verrà selezionata la procedura che meglio garantisce il mantenimento, dopo immobilizzazione, delle proprietà di legame della proteina in soluzione. Perciò le varie classi di composti saranno analizzate e selezionate rispetto alla loro frazione legata e verranno determinati i parametri di legame (KA, ka, kd). In particolare, l'uso del biosensore ottico risulta ottimale nella determinazione dei parametri cinetici. Questo aspetto è particolarmente importante nei criteri di selezione dei composti perchè la cinetica di legame influenza la distribuzione del farmaco. Un'ulteriore caratterizzazione dei parametri di distribuzione di potenziali farmaci sarà ottenuta studiando i siti di legame dei farmaci sulla proteina di trasporto tramite esperimenti di spiazzamento con marcatori selettivi dei singoli siti. Queste informazioni permetteranno di definire i siti di legame per ogni classe di composti e di valutare possibili interazioni con metaboliti e potenziali farmaci co-somministrati. L'interazione fra farmaci rappresenta, infatti, un aspetto cruciale che può determinare un cambiamento della frazione libera del farmaco e quindi della sua attività e tossicità.  Un approccio alternativo alla proteina immobilizzata su fase stazionaria cromatografica è l'uso dell'HSA come fase pseudostazionaria in elettroforesi capillare per ottenere informazioni sulle interazioni farmaco-proteina e farmaco-farmaco. La fase I del progetto riguarderà lo sviluppo delle procedure di immobilizzazione delle proteine su matrice silicea e su superfici specifiche del biosensore, mentre la fase II riguarderà l'applicazione dei sistemi ottenuti allo studio del legame e dei parametri di distribuzione dei composti studiati.

 

A3. Metodologie analitiche innovative nel controllo di qualità, pre-formulazione e formulazione.

La determinazione di impurezze di farmaci in matrici complesse richiede metodi analitici rapidi e selettivi; in questo ambito, tecniche elettrocinetiche verranno utilizzate per sviluppare metodi selettivi ed enantioselettivi per l'analisi di farmaci di sintesi e da estratti di piante. Sistemi elettrocinetici basati su fasi pseudostazionarie doppie (ciclodestrine e tensioattivi ionici) e/o microemulsioni, verranno inizialmente caratterizzati dal punto di vista chimico-fisico. A questo scopo, misure in elettroforesi capillare (CE) saranno volte alla valutazione della forza di legame nell'interazione fra tensioattivi e ciclodestrine e le informazioni così ottenute verranno integrate con i risultati ricavati dall'applicazione di altre tecniche chimico-fisiche indipendenti (dynamic light scattering e spettroscopia di risonanza paramagnetica). In particolare, deve essere tenuta in considerazione l'entità dell'interazione e la stechiometria del complesso fra ciclodestrine e tensioattivi, che agiscono come componenti della fase pseudostazionaria in CE, per poter chiarire i meccanismi del processo di separazione Successivamente, l'applicazione dei sistemi così caratterizzati sarà diretta alla determinazione di biomarcatori vegetali in una serie di estratti di piante anche di uso alimentare. Precisamente, ( -)-catechina e ( -)-gallocatechina sono stati individuati quali utili biomarcatori nel processo di degradazione in estratti di piante in quanto la loro presenza nel campione è esclusivamente correlata alla epimerizzazione di ( -)-epicatechina e ( -)-epigallocatechina, due metaboliti secondari fra i più diffusi nel regno vegetale. Poiché la cinetica di epimerizzazione si è dimostrata particolarmente veloce, la presenza di questi composti esogeni in alimenti ed estratti di piante può essere considerata una importante evidenza della avvenuta degradazione del prodotto. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che ( -)-catechina possiede una minore biodisponibilità rispetto alla ( +)-catechina naturale [49]. Per questi motivi, la determinazione di tali biomarcatori verrà proposta come un utile ausilio per la valutazione della qualità di alimenti ed estratti vegetali così come sarà sfruttato per acquisire informazioni riguardanti i processi produttivi manifatturieri a cui sono sottoposti e per assicurare la conformità dei prodotti ottenuti con le leggi vigenti. La convalida dei metodi sviluppati così come la fase di elaborazione dei dati ottenuti in fase applicativa, saranno condotte mediante approccio chemometrico .