Foto del docente

Maria Laura Bolognesi

Professoressa ordinaria

Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie

Settore scientifico disciplinare: CHIM/08 CHIMICA FARMACEUTICA

Coordinatrice del Corso di Laurea Magistrale a ciclo unico in Chimica e tecnologia farmaceutiche

Temi di ricerca

Parole chiave: multititarget drug discovery progettazione e sintesi malattie tropicali dimenticate malattie da prioni Alzheimer's disease molecole ad attività antiparassitaria teranostici

I risultati non incoraggianti ottenuti nel trattamento della malattia di Alzheimer con i farmaci presenti sul mercato ci ha  fortemente motivati nell'intraprendere una nuova strategia di progettazione rivolta all'individuazione di molecole multifunzionali, cioè singole entità chimiche dotate di attività biologiche multiple, tutte benefiche nel combattere la malattia. Questo approccio definito come “multi-target-directed drug design strategy” emerge come un paradigma innovativo e promettente  nella scoperta di farmaci per la cura di malattie multifattoriali, quali sono le patologie neurodegenerative. Riteniamo, inoltre, che esso possa risultare vincente contro altre patologie complesse, quali cancro e malattie parassitarie, che rappresentano ulteriori campi verso cui abbiamo rivolto l'attività di progettazione e sintesi. 

L'attività di ricerca nell'ultimo triennio si è imperniata sulla progettazione e sintesi di piccole molecole, quali strumenti d'indagine farmacologia o potenziali farmaci, seguendo la strategia definita dall'acronimo MTDL (Multi-Targeted-Directed Ligands).

Questo paradigma, emergente nel campo della scoperta di farmaci, si basa sul presupposto che molte delle patologie che oggi affliggono l'umanità sono complesse, vale a dire non attribuibili ad una singola mutazione genetica, ma piuttosto caratterizzate da una patogenesi che coinvolge diversi bersagli molecolari. Alla luce di queste considerazioni, risulta più facile interpretare l'insuccesso che farmaci classici, cioè monofunzionali, hanno riportato nella cura di patologie multifattoriali, quali le malattie neurodegenerative ed il cancro.

Questi rappresentano appunto i due temi centrali della linea di ricerca:

 

1-     progettazione, sintesi e valutazione biologica di ligandi multifunzionali per la terapia e lo studio della malattia di Alzheimer (AD)

2-     progettazione, sintesi e valutazione biologica di ligandi multifunzionali per la terapia e lo studio del cancro

 

1) La comunità scientifica ha oggi raggiunto un sostanziale consenso sul fatto che l'eziologia dell'AD sia multifattoriale e che quindi richieda farmaci ad azione multipla, in grado cioè di indirizzarsi verso diversi target e pathway patogenetici coinvolti. In questa prospettiva, inizialmente l'uso di combinazioni di farmaci si è rivelato promettente e seguito nella pratica clinica, ma non ha condotto a risultati definitivi. A dimostrazione dell'interesse dell'industria farmaceutica nel campo, va comunque sottolineato negli ultimi anni che i brevetti di combinazioni di farmaci ad attività anticolinesterasica hanno superato quelli relativi a nuove entità chimiche.

Al contrario, lo sviluppo di farmaci multifunzionali (Multi-Targeted-Directed Ligands, MTDLs) sembra possedere un maggiore potenziale terapeutico. Intuitivamente l'uso di un solo farmaco con diverse azioni farmacologiche ha inerenti vantaggi rispetto alla combinazione di farmaci: non presenta lo svantaggio dovuto alla somministrazione contemporanea di diversi principi attivi con diversi profili di biodisponibilità, farmacocinetica e metabolismo. Inoltre, non è trascurabile il fatto che essi semplificherebbero notevolmente il regime terapeutico dei pazienti AD, che presentano i risaputi problemi di compliance.

Tutte queste considerazioni ci hanno fortemente motivato nella ricerca di nuovi MTDLs per la cura dell'AD.

Il punto di partenza per lo sviluppo di molti ligandi è stato rappresentato dagli inibitori dual binding dell'enzima acetilcolinesterasi (AChE), vale a dire molecole in grado di interagire con il sito attivo e periferico dell'enzima, e quindi di modulare l'attività catalitica ed anche l'azione pro-aggregante nei confronti della proteina b-amiloide. La modificazione razionale della loro struttura, in modo da aggiungere frammenti latori di un'ulteriore attività benefica nell'AD si è rivelato un approccio di successo.

In particolare, l'inserimento, all'interno di una catena poliamminica in grado di contattare entrambi i siti dell'enzima, del nucleo benzochinonico caratteristico dell'ubichinone, ha prodotto un nuovo MTDL, denominato Memoquin (1), rivelatosi un promettente candidato farmaco per il trattamento dell'AD. Infatti, in seguito ad una estensiva caratterizzazione farmacologica in vivo ed in vitro Memoquin è emersa come una nuova entità chimica capace di attaccare la patologia su più fronti: inibendo l'enzima AChE, la produzione di radicali liberi e la formazione ed aggregazione della beta-amiloide.

A questo proposito, uno studio CD ha permesso di confermare sperimentalmente il meccanismo di inibizione amiloidea, portando alla conclusione che 1 determina una diminuzione della velocità della fase di transizione conformazionale della proteina, con un effetto inibitorio sulla possibilità del peptide di assumere una conformazione a foglietto- beta.

L'eccezionale profilo multifunzionale esibito da Memoquin in vivo, costituisce un avanzamento importante nella ricerca di nuove terapie basate su MTDLs, e soprattutto ha costituito per noi la prova di principio. Inoltre, ha posto le basi per lo sviluppo di una nuova classe di MTDLs a struttura 2,5-bis-diamminobenzochinonica, ottenuti attraverso modificazione sistematica del lead.

Esplorando le SAR di 1, è stata generata una serie di 25 derivati che hanno contribuito alla comprensione del ruolo e della funzione di diversi target molecolari e alla definitiva validazione della strategia di progettazione.

Lo sviluppo di una metodologia sintetica ad alte rese ed applicabile a sintesi su larga scala ha permesso di ottenere agevolmente i composti progettati.

In un lavoro successivo, l'elettroattività di Memoquin, dovuta alla presenza dell'anello chinonico, è stata sfruttata per sviluppare un metodo cromatografico in HPLC, con rivelatore volumetrico, applicato con successo alla separazione di 1 dagli altri analoghi e che ha permesso il confronto delle proprietà elettrochimiche dei composti della serie.

Consapevoli che la scelta del target è fondamentale nel determinare l'efficacia terapeutica di un farmaco multifunzionale, abbiamo rivolto la nostra attenzione nei confronti di un ulteriore target, emergente nelle malattie neurodegenerative, quali la disomeostasi dei metalli. A questo scopo, attraverso progettazione razionale, un importante candidato farmaco, la bis-tacrina, è stato trasformato in un composto mostrante contemporaneamente tre attività contro l'AD: lo spaziatore eptametilenico è stato modificato in modo da inserire degli eteroatomi in grado di svolgere azione chelante nei confronti di rame e ferro, mentre le attività anticolinesterasica ed anti-aggregante sono state conservate. I ligandi sintetizzati hanno quindi soddisfatto le aspettative, e soprattutto la strategia di progettazione ha permesso di ottenere MTDLs senza aumento delle dimensioni molecolari del composto di partenza, con ripercussioni positive sul profilo farmacocinetico.

In linea con questo approccio, più di recente l'attenzione è stata rivolta verso MTDLs recanti anche attività modulatoria nei confronti del recettore NMDA del glutammato. Inibitori di questo recettore, quali il farmaco memantina, emergono come terapie in grado di agire sulle cause della patologia e non soltanto possedere un effetto palliativo. Queste considerazioni ci hanno convinto a progettare composti in grado di inibire contemporaneamente i recettori NMDA, la produzione di ROS e la formazione di beta-amiloide. E' stata sintetizzata una nuova serie di derivati bivalenti della tacrina, denominati carbacrine, con interessante profilo di attività.

 

2)    Progettazione e sintesi di MTDL contro il cancro

Come anticipato, anche il cancro è una patologia cosiddetta complessa, che richiede strumenti terapeutici adeguati a rispondere a questi criteri di complessità. Per questo motivo nella pratica clinica si fa uso di cocktail di farmaci, mentre, a livello di ricerca e sviluppo, sta sempre più prendendo piede la progettazione di MTDLs. Seguendo una strategia simile a quella portata avanti nell'Alzheimer, sono state progettate molecole in grado di modulare un target validato nella terapia antitumorale, quale il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), ed anche contemporaneamente di indurre l'apoptosi. In dettaglio, è stato selezionato un frammento anilinochinazolinico come motivo di riconoscimento del recettore. Questa scelta è stata motivata dal fatto che sono già presenti sul mercato farmaci antitumorali a struttura simile e soprattutto perché questo nucleo rappresenta una struttura “privilegiata” con alto potenziale di drug-likeness. Infatti, oltre ad essere presente nella struttura di molti antagonisti alfa-adrenergici, la chinazolina è stata usata con successo nella progettazione di farmaci in grado di interagire con diversi bersagli molecolari. Il nucleo chinazolinico è stato quindi combinato con un frammento di acido lipoico (LA), con azione pro-apoptotica e in grado di legare irreversibilmente una Cys del recettore, attraverso la formazione di un legame disolfuro. Questa inibizione, fondamentale per l'ottenimento dell'effetto terapeutico, è molto più selettiva rispetto a gruppi più reattivi, quali le acrilammidi presenti in letteratura e quindi in grado di conferire una maggiore biodisponibilità. Inoltre l'acido lipoico è un antiossidante multifunzionale, con un profilo terapeutico utile nel trattamento del cancro e di tutte quelle patologie nella cui patogenesi è implicato lo stress ossidativo. Esso rappresenta quindi un buon frammento nella progettazione di ligandi multifunzionali.

Un'altra seria di molecole antitumorali sviluppate è rappresentata dai poliamminochinoni. In questo lavoro il punto di partenza della progettazione è stato la considerazione che le molecole naturali rappresentano una porzione pre-validata e rilevante da un punto di vista biologico dello spazio chimico, in quanto già esplorata dalla natura. Su questa base, attraverso un approccio di sintesi parallela assistita da polimeri, è stata sintetizzata una libreria di 24 derivati ottenuti combinando 2 scaffolds naturali con potenziale nel cancro, quali i chinoni e le poliammine. I nuovi derivati possono essere considerati MTDLs, in quanto, conservano potenzialmente le azioni antitumorali dei frammenti di partenza (modulazione dei recettori ad attvità tirosin chinasica, intercalazione al DNA e formazione di addotti covalenti, formazione di radicali liberi, inibizione della topoisomerasi ed enzimi della biosintesi di poliammine). Inoltre, grazie alla presenza della catena poliamminica, potrebbero sfruttare trasportatori specifici per indirizzarsi alle cellule tumorali che presentano un elevato intake di poliammine.

Il prototipo di questa serie di composti, FR18, ha dimostrato in una linea cellulare di carcinoma umano attività antiproliferativa a concentrazioni nanomolari, inibendo il legame del fattore di crescita EGF al suo recettore EGFR. In maniera ancora più interessante, esso si è rivelato in grado di inibire l'apoptosi. Questo profilo conferma il potenziale terapeutico della nuova classe sviluppata.

 

Una nuova linea di ricerca appena avviata, ha riguardato la:

3) Progettazione e sintesi di candidati farmaci per le malattie tropicali dimenticate

Tripanosoma e Leishmania sono i vettori eziologici di una serie di malattie, quali la malattia di Chagas, la malattia del sonno africana e la leishmaniosi nelle sue varie forme, tristemente note con il termine di malattie tropicali dimenticate. In Africa, Sud America e Asia sono presenti devastanti malattie che colpiscono milioni di individui, ma la condizione di generalizzata povertà fa sì che le industrie farmaceutiche, non avendo ritorno economico, non investano nella ricerca di nuovi farmaci. Per questo motivo è una responsabilità inderogabile del settore accademico e pubblico l'assicurare una ricerca di base in questo campo.

Il nostro contributo si basa finora su due approcci: progettazione structure-based e sintesi di librerie di composti.

Nel primo caso il target molecolare selezionato è stato l'enzima tripanotione reduttasi. Questo enzima è vitale per i parassiti, presenta adeguate differenze strutturali rispetto alla controparte umana (l'enzima glutatione reduttasi) e si presta all'inibizione da parte di piccole molecole.[5]

Nel secondo caso, attraverso l'approccio dello sfruttamento di frammenti naturali nella costruzione di librerie di piccola taglia, ma con elevato hit rate, sono stati identificati diversi derivati chinonici attivi nei confronti delle diverse specie di parassita. Il problema della serie è una generalizzata citotossicità, presentando solo un derivato un indice di selettività di 80, non lontano dal parametro 100, selezionato dal WHO come prerequisito per la progressione di un lead alla fase pre-clinica.