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Andrea Bolognesi

Professore associato confermato

Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale

Settore scientifico disciplinare: MED/04 PATOLOGIA GENERALE

Temi di ricerca

Le ricerche correnti si focalizzano sulle seguenti tematiche:

1) Studio delle RIP in specie di interesse agro-alimentare. Ricerca di RIP in varie specie coltivate e non, per cercare di comprenderne distribuzione e ruolo fisiologico.
2) Sequenziamento e clonazione di RIP di particolare interesse.
3) Studi di correlazione struttura/funzione. Studi di struttura mediante diffrazione ai raggi X e correlazione con la specificità dell'azione enzimatica.
4) Studi sul meccanismo di intossicazione cellulare. Ricerche su modalità di legame alla cellula, endocitosi, routing intracellulare, sequenza temporale del danno ad rRNA, DNA o eventuali altri substrati e meccanismo di morte cellulare.
5) Chemoablazione sperimentale mediante tossine. Sviluppo di una nuova terapia per lo strabismo e per le distonie oculo-motorie, mediante somministrazione locale nei muscoli extraoculari di RIP libere o coniugate.
6) Coniugati carrier/tossina per la terapia sperimentale anti-tumorale e immunosoppressiva. Realizzazione e sperimentazione in-vitro e in-vivo di nuove immunotossine, chimiche o ricombinanti, per la terapia di tumori ematologici, della GvHD e del rigetto dei trapianti.



Le proteine inattivanti i ribosomi (ribosome-inactivating proteins o RIP) appartengono strutturalmente a due classi: RIP di tipo 1, a singola catena ad attività enzimatica, e RIP di tipo 2, a doppia catena, una catena A ad attività enzimatica legata mediante ponte disolfuro ad una catena B di tipo lectinico. La capacità della catena B di legarsi a recettori sulla superficie cellulare, favorisce l'internalizzazione della catena A, rendendo le RIP di tipo 2 molto più tossiche delle RIP di tipo 1. E' stato dimostrato che le RIP sono in grado di rimuovere un'adenina dall'rRNA, da cui il nome rRNA N-glicosilasi (o rRNA N-glicoidrolasi EC 3.2.2.22). Su questo argomento si sviluppano più linee di ricerca. 1-Studio delle RIP in specie di interesse agro-alimentare. Le RIP sono estremamente diffuse nel regno vegetale e la loro presenza è stata riscontrata anche in varie piante eduli, quali zucca, barbabietola, asparago e spinacio. Con la presente ricerca ci si propone di estendere lo screening dell'attività RIP nelle specie vegetali non ancora indagate, al fine di comprenderne la distribuzione. Particolare attenzione sarà poi posta nei confronti delle specie di interesse agro-alimentare, nelle quali i livelli di RIP nelle varie parti della pianta saranno messi in relazione con la varietà coltivata ed il periodo vegetativo e con situazioni di stress ambientale quali alte o basse temperature, disidratazione e presenza di agenti patogeni. Dalle piante in cui è presente attività, verranno anche isolate e purificate nuove RIP, al fine di estendere gli studi di tipo biochimico e tossicologico o, eventualmente, per un loro impiego biotecnologico. 2- Studi di correlazione struttura/funzione. Il ruolo delle RIP in natura è a tutt'oggi ancora sconosciuto. Gli studi enzimologici condotti nel nostro laboratorio hanno portato all'identificazione di nuovi substrati per le RIP, differenti dall'rRNA, già riportato in letteratura, quali altri RNA, acidi nucleici virali, poli A e DNA. Gli studi enzimologici condotti sulle nuove RIP purificate e su quelle già note saranno messi in correlazione con la presenza di particolari domini della struttura terziaria. La struttura tridimensionale delle RIP sarà determinata mediante cristallizzazione e diffrazione ai raggi X. Verrà inoltre calcolato il potenziale di superficie delle molecole, con particolare riguardo alle cariche presenti nel sito attivo, per meglio comprendere le differenze nell'interazione con i vari substrati. Per studiare l'interazione RIP-ribosoma saranno inoltre introdotte mutazioni puntiformi nel sito attivo di RIP selezionate, per prevenire il clivaggio dell'adenina senza modificare le proprietà di legame ai ribosomi. 3-Studi sul meccanismo di intossicazione cellulare. Lo studio dell'interazione cellulare delle RIP è di grande interesse, sia per la correlazione esistente tra tossicità in vivo e citotossicità, sia per le ricadute che può avere sull'impiego clinico di queste molecole. La presente linea di ricerca valuterà la modalità di legame delle RIP alla membrana cellulare, l'endocitosi e il routing intracellulare. Saranno inoltre studiati il meccanismo di morte cellulare e la sequenza temporale del danno all'rRNA, al DNA o ad altri substrati. 4-Chemoablazione sperimentale mediante tossine. La RIP saporina, coniugata all'anticorpo mAb73 specifico per il recettore dell'acetilcolina, è stata utilizzata per indurre un danno localizzato alle cellule muscolari extraoculari. Questa immunotossina, nel muscolo retto mediale di coniglio, ha provocato un danno muscolare localizzato senza determinare alcuna reazione infiammatoria e senza danneggiare i tessuti adiacenti, a differenza del trattamento con doxorubicina. Attualmente sono in corso studi per l'impiego di nuove RIP di tipo 2, purificate nel nostro laboratorio, che avrebbero il vantaggio rispetto all'immunotossina anti-AchR di colpire anche le cellule muscolari immature, impedendo la rigenerazione. Questa ricerca di tipo traslazionale si propone di sviluppare una nuova terapia per lo strabismo e per le distonie oculo-motorie, patologie attualmente trattate, con scarso successo, per via chirurgica o mediante tossina botulinica. 5-Coniugati carrier/tossina per la terapia sperimentale anti-tumorale e immunosoppressiva. Le immunotossine preparate con le RIP sono state utilizzate per eliminare cellule nocive o indesiderate soprattutto nella terapia antitumorale, nella profilassi e nella terapia del rigetto dei trapianti e della GVHD e nelle malattie autoimmuni. L'attuale disponibilità di anticorpi umanizzati permetterebbe la realizzazione di nuove immunotossine dotate di maggiore stabilità e minore immunogenicità. Tali molecole, previa sperimentazione in-vitro e in modelli animali, potrebbero trovare applicazione clinica principalmente nella terapia dei tumori ematologici, specie nel caso di malattia minima residua o di neoplasie refrattarie alle terapie convenzionali.Verranno studiate particolarmente immunotossine antiCD22 per la terapia sperimentale dei Linfomi Non-Hodgkin. L'anticorpo umanizzato Epratuzumab sarà coniugato a diverse RIP di tipo 1. L'efficacia antitumorale di tali immunotossine verrà valutata, in vitro, su colture cellulari umane derivate da linfomi B e, in vivo, in modelli animali di topi SCID, trapiantati con cellule linfomatose di derivazione umana.

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