Stefano Luciano Ciurli

L'interesse principale della ricerca e' la comprensione del ruolo degli ioni metallici nelle biomolecole. Gli obiettivi sono determinare la struttura molecolare di metallo-enzimi idrolitici e redox, e di metallo-proteine adibite al trasporto degli ioni metallici, e stabilire il rapporto tra la struttura e la funzione della biomolecola. Proteine contenenti ioni di metalli di transizione sono isolate con tecniche di biologia molecolare, e la loro struttura è determinata utilizzando la spettroscopia NMR e la biocristallografia in modo complementare e sinergico con la spettroscopia di raggi X, il biomodeling, la chimica computazionale, la spettroscopia di fluorescenza, il light scattering (dinamico e multi-angolo) e la microcalorimetria, allo scopo di studiare lo stato di oligomerizzazione delle biomolecole e la termodinamica del binding di ioni metallici alle proteine, oltre che approfondire il ruolo degli ioni metallici nella formazione di complessi proteina-proteina e proteina-DNA.

Il progetto principale è lo studio della chimica dell'ureasi, un enzima contenente nichel, che catalizza l'idrolisi dell'urea a dare ioni ammonio e bicarbonato nell'ultimo stadio della biomineralizzazione dell'azoto organico. Inibitori dell'ureasi possono aumentare l'efficienza della fertilizzazione azotata con urea e per diminuire gli effetti negativi delle infezioni dell'apparato gastrointestinale e urinario da parte di batteri patogeni ureolitici. La progettazione di inibitori efficienti, ed aventi minimo impatto ambientale e umano, necessita della struttura molecolare del sito attivo per lo structure-based molecular design. La struttura della ureasi è stata determinata nello stato nativo sia con tecniche cristallografiche che con spettroscopia d'assorbimento di raggi X. Questa rivela la coordinazione di molecole d'acqua agli ioni nichel e il loro stato di protonazione, un dettaglio fondamentale per comprendere il meccanismo catalitico. La struttura cristallografica della ureasi inibita in presenza di fenilfosforodiamidato indica la presenza del suo derivato idrolitico acido diamidofosforico, (HO)P(O)(NH2)2, un analogo dello stato di transizione dell'idrolisi enzimatica dell'ureasi, coordinato agli ioni nichel sito attivo. Ciò ha permesso di stabilire un meccanismo catalitico in perfetto accordo con i dati cinetici e biochimici disponibili. Il meccanismo coinvolge l'attacco idrolitico dello ione idrossido a ponte tra i due ioni nichel su una molecola di urea legata a ponte tra i due ioni, identificando così il ruolo degli ioni Ni(II) nell'idrolisi enzimatica dell'urea. Il meccanismo è stato confermato dalla struttura della ureasi complessata con l'acido borico, un analogo del substrato urea, e da calcoli quantomeccanici. Lo studio delle proteine accessorie necessarie per il trasporto del nichel (UreE) e per l'assemblaggio in vivo del sito metallico (UreD, UreF, UreG) rappresenta una nuova possibilità di identificare nuovi possibili targets per il drug design. Le proprietà strutturali della proteina UreE sono state studiate in soluzione e allo stato solido. La struttura cristallografica è coerente con il ruolo di trasportatore di nichel per questa proteina. Uno studio effettuato utilizzando la spettroscopia NMR biomolecolare e la spettroscopia d'assorbimento di raggi X ha permesso di delucidare la struttura del sito di legame del nichel alla UreE in soluzione come costituito da due ioni Ni2+ legati a ponte da uno ione idrossido. Questa struttura ha suggerito un nuovo meccanismo di rilascio del nichel al sito attivo dell'ureasi sottoforma del frammento [Ni(OH)Ni]3+. Le costanti di legame di UreE per il Ni e lo Zn sono state misurate mediante esperimenti di dialisi all'equilibrio, e più recentemente, con titolazioni microcalorimetriche. E' stato poi sviluppato un protocollo per l'isolamento di UreG da diversi microorganismi. La combinazione di cromatografia d'esclusione molecolare e diffusione della luce (multiple angle light scattering accoppiato al dynamic light scattering, MALS/QELS) ha dimostrato che UreG è presente in soluzione allo stato monomerico o dimerico. La struttura secondaria, determinata utilizzando la spettroscopia di dicroismo circolare, ha indicato la presenza di eliche (15%) e filamenti (29%) oltre a grandi porzioni di proteina non strutturata. La spettroscopia NMR in soluzione ha permesso di identificare UreG come una proteina naturalmente non-ripiegata (IUP: intrinsically unfolded protein). L'attività GTPasica di UreG è stata dimostrata, confermando il ruolo di questa classe di proteine nell'accoppiamento bioenergetico all'inserimento degli ioni Ni2+ nel sito attivo dell'ureasi. Le proprietà di metal-binding di UreG sono state determinate utilizzando dialisi all'equilibrio, analisi elementare con ICP-ES, e titolazioni microcalorimetriche. La struttura dell'UreG nello stato nativo è stata calcolata utilizzando algoritmi di fold recognition ed è perfettamente coerente con l'attività enzimatica e le altre proprietà biofisiche. Le proprietà idrodinamiche di UreG sono state infine studiate utilizzando la spettroscopia di fluorescenza. Un approccio analogo a quello utilizzato per UreG è in corso d'applicazione anche per le metallo-chaperonine UreD e UreF. Studi di biomodeling hanno suggerito che UreF è un analogo di proteine GAP, note per attivare le GTPasi, mentre il dominio N-terminale dell'UreD possiede analogie strutturali con le proteine rho, note per formare complessi ternari con GEF e GTPasi, attivandoli. Se quest'ipotesi sarà confermata, essa porterebbe ad una profonda rivisitazione dell'attuale modello d'azione delle chaperonine dell'ureasi, chiarirebbe notevoli punti oscuri, e fornirebbe una base utile per altre sperimentazioni. Recentemente è stata iniziata una nuova linea di ricerca su una proteina denominata NikR, responsabile della regolazione, mediata dal nichel, di diversi geni essenziali in Helicobacter pylori, un importante patogeno umano.