Sviluppo e applicazione di tecniche FFF e loro derivate per: a)
separazione e caratterizzazione di macromolecole, nanoparticelle e
microparticelle di interesse biologico, ambientale ed alimentare;
b) accoppiamento con tecniche di analisi morfologica non correlate
per la caratterizzazione di analiti nano- e microdispersi; c)
accoppiamento con metodi di rivelazione ultrasensibili per lo
sviluppo di immuno- e biosensori a flusso; d) dispositivi
miniaturizzati biocompatibili monouso. L'attività di ricerca è
applicata ai seguenti temi: 1) invenzione di nuovi metodi di
separazione e selezione di batteri e cellule; 2) accoppiamento con
tecniche di rivelazione quali chemiluminescenza (CL), laser
scattering, e spettrometria di massa (MS) per 3) analisi e
caratterizzazione di proteine e complessi proteici allo stato
nativo in fluidi biologici e frazioni subcellulari, proteine
funzionali ed allosteriche, proteine ricombinanti.
Analisi di
nanoparticelle: La sintesi e la caratterizzazione
di materiali nanostrutturati sono alla base di futuri sviluppi e
applicazioni delle nanotecnologie, dall'elettronica alle tecnologie
biomediche. E' stata esplorata la possibilità di impiegare la
tecnica FFF a campo di flusso (FlFFF) per il frazionamento e la
caratterizzazione dimensionale di analiti nanodispersi d'interesse
nelle scienze dei materiali per applicazioni di carattere
nano-biotecnologico. La FlFFF è stata, ad esempio, applicata al
frazionamento e all'analisi dimensionale di nanoparticelle di
silice e di biossido di titanio sintetizzate in presenza di
modificatori fluorescenti. La FlFFF si è dimostrata adatta al
controllo dei processi di sintesi delle strutture
multi-cromoforiche, che sono state poi ulteriormente caratterizzate
mediante tecniche spettrometriche e microscopiche. La FlFFF è stata
inoltre impiegata per il frazionamento di nanotubi di carbonio
(CNT) funzionalizzati. Nell'ambito del Progetto Strategico di
Ateneo 2006 – Giovani “LIGHT4HEALTH” (coordinatrice: N. Zaccheroni)
è stata iniziata l'applicazione della FlFFF accoppiata alla
rivelazione laser-scatter multiangolo (MALS) per l'analisi di
nanoparticelle fluorescenti in applicazioni nel campo della
medicina.
Analisi di microparticelle disperse: Nell'ambito
del Progetto Strategico di Ateneo 2006 – Senior “STARCHitecture”
(coordinatore P. Trost), è stata iniziata l'applicazione della
tecnica FlFFF-MALS e FFF a campo gravitazionale (GrFFF) per la
separazione e caratterizzazione di particelle di amido, e dei loro
prodotti di degradazione idrolitica/enzimatica, provenienti da
mutanti genetici di cereali.
Selezione cellulare: La maggioranza delle
metodologie per selezione cellulare, quali Magnetic-Activated Cell
Sorting e Fluorescent-Activated Cell Sorting, fa uso di marcatori
immunologici. Per talune applicazioni, tuttavia, gli specifici
marcatori possono non essere disponibili, o il processo stesso di
marcatura può interferire con la vitalità o la funzionalità delle
cellule selezionate. La ricerca, quindi, di nuove metodiche per la
selezione cellulare senza marcatura rappresenta un settore di
notevole interesse soprattutto nel campo della ricerca sulle
cellule staminali. In collaborazione con il Prof. G.P. Bagnara
(Dip. Istol., Embriol. e Biol. Applicata) è stata studiata la
possibilità di impiegare metodiche separative derivate dalla GrFFF
per la selezione di cellule staminali umane adulte. Tali cellule
possono essere isolate da diversi tessuti dell'organismo e
utilizzate per rigenerare in vivo tessuti danneggiati o creare ex
vivo nuovi tessuti, con promettenti applicazioni in medicina
rigenerativa. È stata sviluppata e brevettata a nome dell'Ateneo
(WO07128737) una nuova tecnica per l'arricchimento e la selezione
di cellule staminali umane multipotenti, il cui sviluppo procede al
fine di un loro utilizzo per applicazioni biomediche.
Analisi di proteine: Nell'ambito del contratto di
collaborazione con l'azienda Wyatt Technology Europe (Germania),
viene sviluppata da un punto di vista strumentale e metodologico la
tecnica accoppiata FlFFF-MALS per l'analisi e caratterizzazione di
lipoproteine nel siero, al fine di applicazioni
analitico-cliniche.
I depositi fibrillari tipici delle amiloidosi neurodegenerative,
quali il morbo di Alzheimer (Alheimer's disease, AD), sono
principalmente costituiti da proteine β-amiloidi (Aβ). In
particolare, il peptide di 42 aminoacidi
Aβ1-42 va incontro ad un processo di
polimerizzazione per nucleazione, nel quale i monomeri si
auto-assemblano in intermedi oligomerici che costituiscono una
popolazione eterogenea di aggregati globulari. In collaborazione
con la Prof. E. De Lorenzi (Dipartimento di Chimica Farmaceutica,
Università di Pavia), si è dimostrata la capacità della F4-MALS di
monitorare l'evoluzione delle specie prefibrillari e fibrillari di
Aβ1-42, e di fornire informazioni qualitative e
quantitative sui relativi aggregati. È stato inoltre sviluppato
l'originale accoppiamento tra MS e HF FlFFF per l'analisi di
proteine intatte e di complessi proteici in forma nativa, per la
caratterizzazione di proteine funzionali ricombinanti di interesse
farmaceutico e di campioni proteici complessi come il siero del
sangue umano intero. Nell'ambito del coordinamento locale del
Progetto PRIN 2006 “Integrazione di metodologie innovative di
separazione e di spettrometria di massa per una proteomica di nuova
generazione” (Coordinatore Nazionale G. Marino) e del Coordinamento
Nazionale del Progetto Grande Rilevanza inserito nel Protocollo di
Collaborazione Bilaterale Italia-Corea 2007-2009, è stata iniziata
l'applicazione delle tecniche HF FlFFF e FFF-MALS accoppiate a
tecniche di proteomica shot-gun quali la
(nano/chip)LC-ESI(Ion-Trap)-MS/MS per la identificazione di
complessi proteici allo stato nativo presenti nel siero e in
frazioni subcellulari.
Metodi immunometrici:
La ricerca, in collaborazione con il Gruppo di Bioanalitica del
Dip. di Scienze Farmaceutiche (Prof. A. Roda) riguarda lo sviluppo
di nuovi formati per metodi immunometrici a flusso. L'impiego di
rivelatori a CL a flusso, accoppiati online post-column al
dispositivo frazionatore (GrFFF-FIA-CL), consente di determinare la
concentrazione dell'analita misurando l'area del picco
frattografico e costruendo l'opportuna curva dose-risposta.
Sfruttando questa strategia è stato sviluppato un metodo
immunometrico non competitivo, che impiega la GrFFF-FIA-CL per la
determinazione di cellule intere (batteri patogeni).
