Aspetti eziologici, diagnostici e di profilassi delle principali
malattie infettive degli animali da compagnia e da reddito;
Bioinformatica applicata allo studio degli aspetti evolutivi,
filogenetici degli agenti infettivi.
PARVOVIRUS DEI CARNIVORI: Parvovirus canino (CPV),
Parvovirus felino (FPV)
(Responsabile di progetto)
a) PARVOVIROSI CANINO CPV-2
- messa a punto di tecniche diagnostiche tradizionali relative alla
Parvovirosi del cane: particolare attenzione è stata rivolta alla
valutazione sperimentale delle tecniche comunemente utilizzate
quali l'isolamento su coltura cellulare, l'ELISA,
l'emoagglutinazione. Sono state valutate le caratteristiche
intrinseche dei tests diagnostici quali sensibilità e specificità
relative, valori predittivi positivi e negativi, grado di
concordanza;
- messa a punto di metodiche diagnostiche biomolecolari: PCR,
Real-Time;
- caratterizzazione genomica e antigenica di ceppi di parvovirus
canino (CPV-2) isolati da carnivori domestici e selvatici con
anticorpi monoclonali specifici e sequenziamento del gene virale
VP2;
- analisi molecolare evolutiva dei ceppi di CPV-2 identificati nei
carnivori domestici e selvatici mediante l'utilizzo di softwares
specifici per l'analisi filogenetica;
- analisi strutturale della proteina del capside VP2 del CPV-2 allo
scopo di valutare le modificazioni strutturali indotte dalle
mutazioni aminoacidiche riscontrate negli isolati italiani;
- studio delle varianti del CPV-2 mediante la produzione di cloni
mutanti utilizzando il metodo di Kunkel;
- studio delle co-infezioni da più varianti di CPV-2 e della natura
di quasispecie virale di ceppi di CPV-2 isolati da cani e gatti,
mediante clonaggio e sequenziamento dei geni NS e VP2;
- identificazione nel genoma del parvovirus canino e felino di
micro-RNA mediante approccio bioinformatico
- Studio quali-quantitativo dell'espressione genica, come mRNA
trascritto, della procalcitonina e di un panel citochinico in corso
di Sindrome di Risposta Infiammatoria Sistemica e Sepsis ad
insorgenza spontanea, con particolare riferimento alla Parvovirosi"
(Progetto di Ricerca Interdipartimentale)
b) PARVOVIRUS FELINO (Responsabile di progetto)
- messa a punto di metodiche diagnostiche tradizionali e
biomolecolari
- analisi evolutiva dei ceppi di parvovirus felini isolati da gatti
domestici
- studio delle co-infezioni in corso di infezione da parvovirus
INFEZIONI DA CORONAVIRUS FELINI (Responsabile
di progetto)
- messa a punto di metodiche biomolecolari (RT-PCR, Real-Time) per
la diagnosi diretta della peritonite infettiva felina;
- studi sulla diffusione dell'infezione da Coronavirus felini nelle
colonie feline e nei gatti di proprietà mediante impiego della
RT-PCR;
- messa a punto della metodica di SSCP e studio della composizione
di quasispecie virale nelle popolazioni di coronavirus felini
identificati in gatti sani e malati;
- caratterizzazione biomolecolare del gene N e predizione di
epitopi stimolanti l'immunità cellulo-mediata sulla base della
sequenza aminoacidica della nucleoproteina N di ceppi di
coronavirus felini;
- sintesi di peptidi immunogeni della proteina N utilizzati per la
stimolazione in vitro di cellule immunocompetenti e successiva
valutazione del profilo citochinico;
- espressione in vitro della proteina N mediante sistema
baculovirus;
- analisi estese del genoma virale mediante sequenziamento genico
allo scopo di identificare mutazioni distintive tra i ceppi
virulenti ed avirulenti;
INFEZIONI EMERGENTI (Responsabile di
progetto)
- Indagini epidemiologiche condotte nelle popolazioni di
pipistrelli per la ricerca ed identificazione di coronavirus
emergenti SARS-correlati
- Caratterizzazione molecolare dei ceppi virali identificati
mediante sequenziamento di estese regioni genomiche ed analisi
filogenetica/evolutiva
Ha inoltre collaborato ai seguenti progetti di ricerca:
ROTAVIRUS AVIARI
- tipizzazione molecolare di ceppi di Rotavirus aviari mediante
elettroforesi in condizioni denaturanti;
PARVOVIRUS DEL SUINO
- applicazione di metodiche diagnostiche biomolecolari per
l'evidenziazione del parvovirus suino (PPV) da diversi materiali
biologici; prove di infezione sperimentale nel suino con circovirus
tipo 2 e PPV e conseguente valutazione del ruolo proteggente
dell'immunità passiva naturale nei confronti di tali agenti.
ECTIMA CONTAGIOSO
- Caratterizzazione molecolare ed antigenica di ceppi virali
responsabili di forme patologiche classiche e proliferative,
attraverso lo studio delle sequenze dei geni della virulenza VEGF,
GMCSF, OVINFR, IL10.
- studio del profilo proteico di ceppi di parapoxvirus ovini
responsabili dell'ectima contagioso delle pecore mediante SDS-PAGE
ed immunoblotting, utilizzando anticorpi monoclonali e
policlonali;
- Clonazione, espressione del gene F1L e messa a punto di una
possibile subunità vaccinale.
BVD-MD
- Indagine epidemiologica in ruminanti domestici e selvatici;
- Messa a punto di metodiche molecolari per la diagnosi
dell'infezione
- Caratterizzazione genomica
-
CALICIVIRUS FELINO
- Caratterizzazione molecolare ed analisi filogenetica di ceppi di
FCV isolati in corso di focolai naturali
- Studio della composizione quasispecie dei ceppi
identificati
CIMURRO DEL CANE
- Messa a punto di metodiche biomolecolari per la diagnosi della
malattia;
- Caratterizzazione molecolare ed analisi filogenetica di ceppi
virali italiani;
- Analisi molecolare del gene che codifica per la proteina del
nucleo capside
- Studio dell'attività antivirale in vitro di molecole di origine
naturale e di sintesi
BETANODAVIRUS
- Caratterizzazione molecolare di ceppi virali isolati nel Mar
Mediterraneo isolati da diverse specie ittiche ed analisi
filogenetiche
La nostra attività di ricerca è finalizzata principalmente
all'identificazione e caratterizzazione molecolare dei principali
virus responsabili di patologie nel cane e nel gatto.
1. INFEZIONI DA PARVOVIRUS NEL CANE E NEL GATTO
Il Canine Parvovirus (CPV-2) e il parvovirus della panleucopenia
felina (FPLV) sono virus a DNA appartenenti al genere Parvovirus,
responsabili di gravi patologie nel cane e nel gatto. Tali virus
hanno un comportamento evolutivo anomalo, con un tasso di mutazione
particolarmente elevato, simile ad un RNA virus. Nel corso degli
anni il CPV-2 è mutato dando origine a nuove varianti, indicate
come CPV-2a, 2b, 2c, che hanno esteso lo spettro d'ospite al gatto.
Le mutazioni che hanno portato all'insorgenza dei nuovi tipi
antigenici sono concentrate a livello del gene VP2 che codifica per
una delle principali proteine del capside, sede di importanti
epitopi che definiscono le caratteristiche antigeniche e biologiche
del virus. Gli studi intrapresi dal nostro gruppo su tale virus
hanno portato all'isolamento da feci di cane di numerosi ceppi di
CPV-2 utilizzando linee cellulari continue di cane e di gatto. I
ceppi sono stati analizzati inizialmente con un patterns di
anticorpi monoclonali specifici che ha evidenziato come la variante
prevalente nel nostro territorio sia la 2a; in seguito è stata
eseguita la caratterizzazione genomica dei ceppi virali mediante il
sequenziamento del gene VP2. Attualmente le nostre ricerche sono
mirate ad approfondire da un lato le caratteristiche biologiche di
ceppi particolarmente virulenti che hanno provocato la malattia in
soggetti vaccinati; dall'altro stiamo svolgendo una serie di
indagini sulla nuova variante 2c, che abbiamo osservato in
infezioni miste ad elevata complessità genetica con più varianti di
CPV-2. Analogamente al CPV-2, studi di caratterizzazione genomica
ed antigenica sono in corso sul virus della panleucopenia felina
FPLV, con particolare riferimento a ceppi isolati da focolai di
malattia a carattere anomalo. Inoltre, stiamo effettuando una serie
di analisi sulle sequenze del gene della VP2 ed NS dei ceppi di
CPV-2 e FPV allo scopo di identificare la presenza di microRNA.
2. INFEZIONI DA CORONAVIRUS FELINI
I Coronavirus sono comuni patogeni dei mammiferi e degli uccelli
caratterizzati da una elevata eterogeneità genetica che è il
risultato dell'accumulo di mutazioni che si determinano nel corso
della replicazione virale. Tra le varie specie di coronavirus che
colpiscono gli animali vanno annoverati in particolare i
Coronavirus Felini (FCoVs) responsabili nel gatto di una grave
patologia a meccanismo immuno-mediato, la peritonite infettiva
felina (FIP). La FIP costituisce tuttora un enigma in quanto
esistono ancora molti dubbi circa i meccanismi patogenetici, e
nessuna terapia e vaccino si è dimostrato efficace. Le nostre
ricerche sono volte ad approfondire le caratteristiche genomiche
dei ceppi di FCoVs identificati in animali portatori sani e malati
e valutare il coinvolgimento della proteina virale N nella
stimolazione immunitaria. Tali obiettivi saranno raggiunti mediante
l'amplificazione del gene N di ceppi di coronavirus felini
evidenziati in gatti sani (ceppi avirulenti) e malati (ceppi
virulenti) che vivono nello stesso ambito; gli ampliconi verranno
poi sequenziati e le relative sequenze nucleotidiche e
aminoacidiche verranno comparate ai fini di evidenziare mutazioni
distintive tra i ceppi virulenti e avirulenti, poichè non sono
ancora note le differenze genomiche tra i due biotipi; ai fini di
identificare la presenza di peptidi immunogeni nella proteina N dei
ceppi virulenti e avirulenti, verrà effettuata la predizione dei
siti antigenici mediante l'utilizzo di algoritmi specifici in
grado, sulla base della sequenza aminoacidica primaria di
identificare la presenza di epitopi stimolanti i linfociti T
helper; una volta identificati i ceppi maggiormente immunogeni si
procederà alla espressione in vitro della proteina N mediante
sistema baculovirus, in modo da mantenere inalterate le
caratteristiche antigeniche e strutturali della proteina nativa. La
proteina N ricombinante, insieme ai peptidi immunogeni verrà
utilizzata per la stimolazione in vitro dei linfociti.
3. VIRUS EMERGENTI: I CORONAVIRUS NEI PIPPISTRELLI
Recenti indagini epidemiologiche condotte in popolazioni di specie
differenti di pippistrelli in Europa e in Asia, hanno sottolineato
l'importanza dei pippistrelli come serbatoi di virus emergenti che
colpiscono gli animali e l'uomo. In particolare, nei pippistrelli
si sono identificate nuove specie di coronavirus, confermando il
ruolo predominante dei pippistrelli come serbatoi e portatori di
coronavirus ancestrali degli animali e dell'uomo. Anche il virus
della SARS si sarebbe originato da coronavirus circolanti nelle
popolazioni di pippistrelli. Allo scopo di approfondire il ruolo
epidemiologico di tali animali, stiamo svolgendo un'indagine in
popolazioni di pippistrelli (Rhinolophus spp.), mediante
l'applicazione di tecniche di biologia molecolare, con l'intento di
evidenziare la presenza di coronavirus dalle feci di pippistrelli.
I ceppi virali saranno successivamente caratterizzari mediante
sequenziamento.
Obiettivi futuri sono di estendere tale indagine ricercando altri
virus.
4. ANALISI DEI MECCANISMI EVOLUTIVI VIRALI
Mediante l'utilizzo di appositi softwares, stiamo studiando i
meccanismi evolutivi dei principali virus patogeni per gli animali
da reddito e da compagnia che sono oggetto di studio nel nostro
laboratorio.
