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Giovanni Martinelli

Professore associato confermato

Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale

Settore scientifico disciplinare: MED/15 MALATTIE DEL SANGUE

Temi di ricerca

Aree principali di ricerca: leucemia mieloide acuta, leucemia linfoblastica acuta, leucemia mieloide cronica: ricerca dei target therapy nelle principali malattie ematologiche: terapia delle leucemie acute, terapia delle leucemie croniche Ph+ e non (HES); trias clinici nazionali ed internazionali.



Risultati ottenuti: Con i finanziamenti RFO, ottenuti dal 2005 al 2013, sono state complessivamente prodotte dal proponente e dai suoi collaboratori riguardo gli obiettivi di ricerca 145 pubblicazioni scientifiche su riviste con un impact factor complessivo pari a 807,2.

RICERCHE CLINICHE:

Riguardo gli obiettivi della ricerca clinica e sperimentale nel corso del 2013 sono stati intrapresi e condotti i seguenti studi: 

1.  Studio clinico bortezomib e tipifarnib in pazienti con LAM resistente/ricaduta. Abbiamo condotto  e completato la seconda fase dello studio di fase II volto a verificare la tossicità e l'efficacia clinica della combinazione di due farmaci, Bortezomib e tipifarnib, in pazienti affetti da LAM resistente/ricaduta. Lo studio, multicentrico, ha visto l'arruolamento di oltre 80 pazienti nelle fasi I e II,  e ha mostrato ottima tolleranza e aderenza al trattamento.  La maggior parte dei malati ha condotto la cura a domicilio,  senza necessità del ricovero ospedaliero nel 70% dei casi, con una significativa riduzione dei gg di ricovero ospedaliero, dei giorni di antibiotico terapia, del numero di trasfusioni di Globuli rossi e piastrine. Fatto ancor piu' rilevante, la sopravvivenza di questi malati e risultata ampiamente superiore nei pazienti trattati con Tipifarnib, rispetto a quelli trattati con terapia di supporto o altre terapie sperimentali. Tra i pazienti responsivi  è stato registrato un rate di risposta, tra cui alcune remissioni complete, pari al 72% in pazienti aventi il genotipo caratterizzato da un alto rapporto dei geni RASGRP1 e APTX, che pertanto e'stato ricercato in 256 pazienti di nuova diagnosi e non afferenti alla ns. struttura ed a strutture consorziate nel progetto, nel periodo 2008/2010.  In questo subset di pazienti (12%),  di cui 16 sono stati arruolati nella fase 3 attualmente in corso, e perchè affetti da Leucemia Mieloide Acuta (LAM) con rapporto RASGRP1/APTX elevato (>10), la risposta clinica e morfologica (>90%) si associa a un significativo incremento della sopravvivenza (>52 mesi!) nonostante la presenza di comorbidità elevate. I risultati dello studio sono oggetto di numerose pubblicazioni scientifiche.   Lo studio si intitola: HEMOS AML0106 (26866138-CAN-2022) "Phase II, Open-Label, Multi-centre, 2-part study to assess the Safety, Tolerability, and Efficacy of Tipifarnib Plus Bortezomib in the Treatment of Newly Diagnosed Acute Myeloid Leukemia (AML) unfit for conventional chemotherapy".

2. Abbiamo ideato, coordinato, ed aperto (ed arruolato 7 pazienti con uno screening su 16 pts.) un Trial clinico e protocollo randomizzato doppio cieco, up-front di CPK412D2201 (Chemioterapia convenzionale con o senza Midostaurina (un farmaco anti FLT3) nei pazienti affetti da LAM con recettore FLT3 mutato ed a cattiva prognosi.  Lo studio è in corso ma finora abbiamo dimostrato la sicurezza e la fattibilità della combinazione terapeutica.   Lo studio si intitola:  "A Phase II Randomized Study of Induction (Daunorubicin/Cytarabine) and Consolidation (High Dose Cytarabine) Chemotherapy + Midostaurin (PKC412) or Placebo in newly diagnosed Patients <60 Years of Age with FLT3 Mutated Acute Myeloid Leukemia".
Un analogo trial clinico  di fase 2, multicentrico, internazionale, in aperto, sulla Mastocitosi sistemica aggressiva, malattia rara ma invalidante e'stato finalizzato con la stessa molecola. Il protocollo clinico (codice EUDRACT 2008-000280-42) e' intitolato "A single arm, phase II, open label study to determine the efficacy of 100mg twice daily oral dosing of Midostaurin administrated to patient with aggressive systemic mastocytosis or mast cell leukemia +/- an associated hematological clonal non mast cell lineage disease". Abbiamo inoltre proseguito l'rruolamento nel protocollo clinico osservazionale del RIMA, il Registro Italiano Mastocitosi inserendo 23 pazienti da noi seguiti clinicamente. 

3. Contemporaneamente abbiamo attivato lo studio clinico  promosso dalla ditta AMBIT con un nuovo inibitore di FLT3 mutato, l'AC220, ed arruolato finora due pazienti, ricaduti e refrattari a precedente chemioterapia. La molecola ha mostrato attività biologica pre-clinica altamente significativa e pertanto lo studio e' altamente interessante. Il Centro di Bologna coordina lo studio Italiano dal titolo: "AC220-002"Phase 2 open-label, AC220 monotherapy efficacy (ACE) study in patients with Acute Myeloid Leukemia (AML) with FLT3-ITD activating mutations".

4. Abbiamo ideato un nuovo studio GIMEMA AML1310 (EudraCT number 2010-023809-36) che si caratterizza per un "Risk-adapted, MRD-directed therapy for young adults with newly diagnosed acute myeloid leukemia"con chemioterapia convenzionale secondo lo schema "3+7", e monitorato sulla risposta molecolare raggiunta mediante studio immunofenotipico di antigeni di superficie espressi abberrantemente.

5. Aurora chinasi e suoi inibitori nelle leucemie mieloidi acute. Le leucemie acute dell'anziano sono spesso incurabili o non trattabili. I malati sopra i 65 anni spesso sono portatori di malattie (pregresso infarto, Diabete scompensato, insufficienza renale, etc) che impediscono le cure con i farmaci convenzionali. Per questi malati, per dare loro una speranza, continueremo a studiare i geni chiamati “AURORA chinasi” e le “POLO kinasi”, così importanti nel determinare la leucemia. Nell'anno 2008 abbiamo partecipato ad uno studio internazionale di fase Ib (AstraZeneca) volto a valutare il profilo di tossicità e l'eventuale efficacia clinica di un nuovo farmaco anti-AURORA A e B in pazienti in fase di ricaduta. Sono stati arruolati 5 pazienti.   Nel 2009, abbiamo iniziato un nuovo trial clinico di fase 2, con associazione di inibitore delle aurora chinasi e /o verso low dose aracytin dal titolo: "D1531C00009: A randomised, open-label, multi-centre, 2-stage, parallel group study to assess the efficacy, safety and tolerability of AZD1152 alone and in combination with low dose cytosine arabinoside (LDAC) in comparison with LDAC alone in patients aged". 

Nel 2009 abbiamo iniziato l'arruolamento in un nuovo studio di fase Ib con un nuovo inibitore di Aurora chinasi (della ditta Merck-Serono) in pazienti con diverse malattie ematologiche, tra cui LAM e LAL.  I risultati eccezionali ottenuti in pazienti affetti da Mielofibrosi idiopatica JAK2 positivi hanno permesso acquisizioni nuove sulle Sindromi Mieloproliferative Croniche (SMC)  in evoluzione blastica oggetto di nuovi studi sperimentali in atto, in collaborazione con il Prof. A. Vannucchi (UniFi).

6. Studio in vitro di inibitori di AKT2 e altri inibitori della via del segnale PI3K nelle leucemie acute. Al fine di predire la risposta a nuove cure e medicine, abbiamo studiato l'effetto di farmaci AKT2 inibitori e potenzialmente efficaci su cellule leucemiche, mediante studi  “in vitro” ossia in provetta, incubando le cellule dei malati con i nuovi farmaci. Questo studio è stato condotto in collaborazione con l'Istituto di Anatomia (Prof. Martelli e Prof. Cocco). Ha permesso di scoprire che alcune leucemie sono potenzialmente “molto sensibili”, mentre altre meno, ed è stato oggetto di pubblicazione scientifica.

Abbiamo completato lo studio AML19"Gemtuzumab Ozogamicin (GO) monotherapy versus standard supportive care for previously untreated AML in elderly patients who are not eligible for intensive chemotherapy: a randomized phase II/III trial (AML-19) of the EORTC-LG and GIMEMA-ALWP". 

A fine 2010 abbiamo attivato un nuovo studio chiamato "AML-001A Phase 3, Multicenter, Randomized, open label, Study Of Azacitidine (Vidaza®) Versus Conventional Care Regimens For The Treatment Of Older Subjects With Newly Diagnosed Acute Myeloid Leukemia" volto a curare ed esplorare l'azione terapeutica della 5-azacytidine, nei pazienti leucemici acuti. 

7. Particolare rilievo ha avuto l'inizio della sperimentazione clinica con inibitori di Hedgehog, e pertanto del self renewal delle cellule staminali leucemiche. Questi composti,  tra cui la molecola A8641014 o PF-04449913, uno SMO inhibitors,  e' entrato in fase clinica precoce, in uno studio di fase I, per la prima volta nell' uomo. Il ns. centro ha arruolato in una dose finding di safety 6 pazienti. Lo studio si intitola: " A Phase 1 study to evaluate the safety pharmacokinetics, and pharmacodinamics  of PF-04449913, an oral Hedgehog  inhibitor, administered as single agent in selected hematological malignancies or in combination with Dasatinib in Chronic Myeloid  Leukemia" (EudraCT Number 2009-011285-29).

Un altro studio clinico promosso da Bristol Myers S. intitolato: CA180-323 Dasatinib (BMS-354825) combined with SMO inhibitor (BMS-833923; XL139) in CML with resistance or suboptimal response to a prior TKI" e' stato sottomesso per approvazione al ISS il15 ottobre 2010 e al nostro CE il 4 novembre 2010.

8.  Abbiamo ideato e realizzato il nuovo trial clinico multicentrico nazionale promosso e sponsorizzato (no Profit)  dal Gimema WP ALL per le leucemie linfoidi acute del giovane in prima ricaduta.  Il Protocollo GIMEMA Dasatinib - Clofa/Edx - LAL1509 e' attualmente sottoposto all'approvazione dei comitati etici di 25 centri italiani ed arruolerà nei primi mesi del 2011.  

Un altro trial clinico di ricerca sulle leucemie linfoblastiche acute dell'anziano, malattia rara ed orfana di strategie terapeutiche e stato approvato ed attivato. Lo studio promosso dal Gimema WP dal titolo "LAL 1104 "Terapia geriatric assessment adapted per il trattamento della Leucemia acuta linfoblastica Ph negativa nell'anziano" prevede l'arruolamento di malati affetti da LAL e trattati secondo comorbidità e perfom status.

9. Abbiamo ideato,  realizzato e condotto il nuovo trial clinico multicentrico nazionale, Protocollo GIMEMA LAL-0904, (Eudract Number 2004-001738-17) di nuovo promosso e sponsorizzato  dal Gimema WP ALL (sponsor "no Profit")  per le leucemie linfoidi acute del giovane sia cromosoma di Ph+ positive che non, con  età  inferiore ai 60 anni, di nuova diagnosi, trattati con inibitori delle TKI (Imatinib e chemioterapia).  Lo studio si intitola “Studio prospettico di fase II sulla terapia della Leucemia Acuta Linfoide (LAL) dell'Adulto: Imatinib associato alla chemioterapia nel trattamento delle forme Ph+, intensificazione della Terapia Post-Remissionale nei pazienti Ph negativi ad Alto Rischio di Recidiva e Monitoraggio della Malattia Minima Residua". Il progetto era quello di trattare i pazienti con chemioterapia convenzionale in associazione con farmaci target specifici. Ha concluso l'arruolamento nel settembre 2010 arruolando 450 pazienti. Abbiamo condotto numerosi studi correlativi traslazionali sulla popolazione in studio (CDK2a Delezioni, Pax5 traslocazioni, frequenza della delezione del gene Ikaros e suo impatto prognostico), che sono stati oggetto di pubblicazioni scientifiche. Contemporaneamente abbiamo comparato i risultati ottenuti nello studio GIMEMA LAL0201 “STI 571 (GLIVEC) in the treatment of Philadelphia-chromosome positive and/or BCR/ABL rearranged adult Acute Lymphoblastic Leukemia” che avevamo condotto precedentemente.

10. Abbiamo ideato,  realizzato e condotto il nuovo trial clinico multicentrico nazionale promosso e sponsorizzato  dal Gimema WP ALL (no Profit)  per le leucemie linfoidi acute del giovane (meno di 35 anni) di nuova diagnosi. Il progetto e' quello di trattare i pazienti con chemioterapia convenzionale secondo schemi simil pediatrici, intensivi, che grandi risultati hanno portato nell' eta' pediatrica.   Il Protocollo GIMEMA LAL-1305 e' attualmente attivo e'abbiamo arruolato due pazienti in novembre 2010. Sottoposto all'approvazione del comitato etico ha ottenuto l'approvazione. "Studio prospettico di fase II sulla terapia della Leucemia Acuta Linfoide (LAL) dell'Adulto: Imatinib associato alla chemioterapia nel trattamento delle forme Ph+, intensificazione della Terapia Post-Remissionale nei pazienti Ph negativi ad Alto Rischio di Recidiva e Monitoraggio della Malattia Minima Residua".

Contemporaneamente, abbiamo attivato lo studio LAL1308 un programma di terapia della Leucemia Linfoide Acuta (LLA) del Giovane Adulto: intensificazione del trattamento secondo il protocollo pediatrico AIEOP LLA-2000 (EudraCT number 2009-016075-30).

11. Abbiamo ideato,  realizzato e iniziato il nuovo trial clinico,  Protocollo GIMEMA LAL-1408, multicentrico, nazionale, promosso e sponsorizzato  dal Gimema WP ALL/CML  (no profit sponsored trial)  per le leucemie linfoidi acute Ph+ dell'anziano (over 60 anni) di nuova diagnosi con inibitori selettivi di BCR-ABL (Nilotinib e Imatinib in rotazione).  Il progetto e' quello di trattare i pazienti  non con chemioterapia convenzionale ma con farmaci "intelligenti". Il protocollo e' attualmente attivo su 27 centri italiani ed ha arruolato 19 pazienti,  a novembre 2010. Sottoposto all'approvazione del comitati etico di Bologna, ha ottenuto l'approvazione. Il protocollo si intitola:  "LAL 1408: Front-line treatment of Ph positive (Ph+)/Bcr-Abl positive Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) with two tyrosine kinase inhibitors (TKI) (Imatinib and Nilotinib). A phase II exploratory multicentric study in elderly patients and in patients unfit".   Un protocollo simile nei giovani affetti da LAL Ph+ e stato preparato e verra'attivato nel 2011: "LAL1509 A multicenter Total Therapy Strategy for De Novo Adult Philadelphia Chromosome Positive (Ph+) Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) Patients".

12. Abbiamo avviato la sperimentazione clinica con il monoclonale ingenerizzato BITE anti CD3 anti CD19 nelle leucemia acute linfoidi in prima ricaduta.  Lo studio si chiama Studio MT103-203 ( Cod. Eudract 2010-018314-75)  ed e' multicentrico, confirmatorio, a singolo braccio, per valutare l'efficacia, la sicurezza e la tollerabilità dell'anticorpo del tipo BITE® blinatumomab in pazienti adulti con malattia residua minima (MRM) da leucemia linfoblastica acuta (LLA) da precursori delle cellule B”.

13. Abbiamo completato lo studio sponsorizzato dall'Istituto Seràgnoli, "HEMOS/BFM ALL 1105" uno studio di fase 2, single centre, basato sulla intensificazione della terapia secondo lo schema BFM e con farmaci modulatori dell'antigene CD20.  "Intensification therapy of mature B-ALL, Burkitt and Burkitt like and other High Grade Non-Hodgkin's Lymphoma in Adults". Lo studio ha arruolato piu di 50 pazienti affetti da linfoma o leucemia di Burkitt, AIDS negativi di giovane eta'ed ha permesso di ottenere risultati brillanti nella terapia di questa forma di leucemia acuta cosi tremenda, per incidenza di ricaduta e di mortalità.

14. Abbiamo iniziato, primi in europa ed unico centro al mondo, una sperimentazione clinica di fase 1 con inibitori selettivi di NOTCH1, mediante inibitori del signaling delle gammasecretasi. Lo studio intitolato A8641014  e' un fase uno.   "A phase 1 trial of pf-03084014 in patients with advanced solid Tumor malignancy and t-cell acute lymphoblastic Leukemia/lymphoblastic lymphoma".  Sottoposto all' ISS il 12 ottobre 2010 e' stato approvato  ed è ora alla approvazione del nostro CE (novembre 2010).

15. Uno studio simile con una inibitore di NOTCH1 prodotto dalla BMS, e' pianificato nel 2011 con una nuova molecola (studio BMS CA216-002) su Leucemia Linfoblastica acuta o Linfoma Linfoblastico.

Nel 2010, abbiamo attivato un trial clinico di fase due con un nuovo gruppo di molecole, inibitori dello switch poket delle tirosino kinasi tra cui bcr- abl. La molecola in sperimentazione ed in ricerca clinica precoce si chiama AP24534. Lo studio si intitola:  "A Pivotal Phase 2 Trial of Ponatinib (AP24534) in Patients with Refractory Chronic Myeloid Leukemia and Ph+ Acute Lymphoblastic Leukemia"  (PACE study).

A questo studio clinico ne è associato un altro intitolato "IDENTIFICATION OF BIOMARKERS TO PREDICT RESPONSE TO PONATINIB (AP24534) IN PATIENTS WITH CHRONIC MYELOID LEUKEMIA AND PHILADELPHIA CHROMOSOME-POSITIVE ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA"volto ad identificare i biomarkers di risposta e di progressione della malattia CML e Ph+.

STUDI CORRELATIVI ED ANALISI PRECLINICHE

16.  Analisi ad alta risoluzione del genoma dei pazienti con leucemia mieloide acuta. Al fine di implementare le conoscenze citogenetiche e molecolari attualmente disponibili per i pazienti con leucemia acuta mieloide e di identificare nuove regioni genomiche di interesse e nuovi sottogruppi molecolari abbiamo effettuato un'analisi genetica ad alta risoluzione mediante mediante SNP-arrays (Affymetrix Human SNP Arrays 6.0). Questa tecnologia consente di individuare alterazioni a livello del contenuto genomico (amplificazioni, delezioni mono- o bialleliche) di regioni cromosomiche inferiori ad 1 kilobase; consente inoltre di identificare regioni di disomia uniparentale e di ipotizzare traslocazioni cromosomiche sbilanciate. Mediante questo approccio sono stati analizzati 105 pazienti con differente FAB e con cariotipo normale (33%) o alterato (73%). Tale analisi ha permesso di evidenziare che i pazienti con LAM presentano molteplici alterazioni (la mediana è di 12 alterazioni per caso), comprendenti interi cromosomi o piccoli intervalli genomici. In particolare, soprattutto nei pazienti a cariotipo normale si è osservata la presenza di alterazioni in regioni comprendenti piu' geni o in alcuni casi di un singolo gene o addirittura di solo una sua parte. Frequenti alterazioni includono l'amplificazione di geni codificanti per fattori trascrizionali (PML, MITF, NOTCH1), proteine tirosino-chinasi, proto-oncogeni (RET, TET2), trasportatori di membrana (ABC transporter gene). Delezioni sono state osservate in geni coinvolti nel controllo del ciclo cellulare (CDKN2A, RB1). 

17. Analisi ad alta risoluzione del genoma dei pazienti con leucemia acuta linfoblastica. Tale studio ha avuto come obiettivo quello di identificare nuove lesioni genetiche nei pazienti con leucemia linfoblastica acuta (Ph+ e Ph-) al fine di definire nuovi marcatori diagnostici e prognostici ed identificare nuovi meccanismi coinvolti nella progressione leucemica. A tal fine, abbiamo utilizzato un approccio molecolare integrato comprendente l'analisi genomica ad alta risoluzione mediante array basati sull'analisi dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), FISH, seguita da amplificazione genomica, clonaggio, sequenziamento e analisi di espressione genica.  Mediante tale approccio sono stati analizzati 150 pazienti con LAL Ph+ e 52 pazienti con LAL Ph-. L'analisi genomica con SNP array ha identificato la delezione del gene IKZF1 codificante per il fattore trascrizionale Ikaros nel 75% dei casi P+ e nel 58% dei casi Ph-.  Ikaros è  fondamentale per lo sviluppo e la differenziazione dei progenitori linfoidi. Abbiamo dimostrato che tale delezione si associa ad un peculiare profilo di espressione genica, caratterizzata da una significativa down-regolazione dei geni coinvolti nel differenziamento dei progenitori B-linfoidi, e da un'up-regolazione dei geni normalmente coinvolti nella proliferazione cellulare, nell'inibizione dell'apoptosi e nel danno al DNA. Conseguenza di tali anomalie è una diminuzione dell'apoptosi in seguito al trattamento con inibitori tirosino chinasici come abbiamo dimostrato in modelli in vitro. Di notevole importanza, questi risultati in vivo  si traducono in una più alta frequenza di ricadute e una minore sopravvivenza libera da malattia sia nei pazienti con LAL Ph+ che nei pazienti con LAL Ph-. 

18. Studio del gene WT1 come marcatore di malattia minima residua nelle LAM. Nell'anno 2011 il laboratorio di biologia molecolare ha inserito tra i marcatori di diagnosi di malattia minima residua la quantificazione del trascritto del gene WT1, che risulta over-espresso nella quasi totalità dei pazienti con LAM. La metodica è stata messa a punto sia su sangue midollare che periferico e appare ben correlare con quella di altri laboratori. Il ruolo di WT1 nella identificazione della malattia minima residua e della previsione di una eventuale ricaduta in pazienti in remissione completa sarà oggetto del lavoro di correlazione clinico-biologica dell'anno 2010.

Studio del gene Notch1 e delle alterazioni associate alle leucemie acute a fenotipo T (T-ALL) e del riarrangiamento del gene IgH e T-Cell receptor, come marcatore di malattia minima residua.

Avendo intrapreso lo studio clinico di fase 1 con inibitori di Notch, abbiamo sviluppato la metodica di sequenziamento massivo del genoma umano di pazienti affetti da ALL Ph+ e del loro trascrittoma (NGS). Lo studio e'avvenuto con la collaborazione del gruppo dell' Università di Verona  e ci ha condotto all'importante scoperta delle mutazioni del gene IDH2 nelle crisi blastiche di CML.

Abbiamo intrapreso uno studio clinico, osservazionale ed investigativo, di fase 2, basato sull'analisi dei polimorfismi dei trasportatori di farmaci attivi sulle leucemie. Questo studio di farmacogenomica, unico nel suo genere,  si intitola: "High resolution genome wide-copy number profiling and pharmacogenomic analysis in Acute Lymphoblastic Leukemia by Single Nucleotide Polymorphism (SNP) arrays". Lo studio, approvato dal ns CE e sottoposto anche alla approvazione del gruppo cooperatore europeo EWALL del leukemiaNet, ha arruolato piu' di 600 pazienti ed ha permesso di identificare varianti alleliche associata alla mancata risposta ai chemioterapici convenzionali e non, ed una aumentata suscettibilità alla leucemia.

I principali obiettivi dei progetti di ricerca nel 2014 saranno:

1. Farmacogenetica e farmacogenomica nella LMC e nella leucemia acuta linfoblastica Ph+. L'eventuale responsabilità di alterazioni nei livelli di espressione e/o nell'attività degli enzimi che regolano la biotrasformazione (CYPs) e l'influsso/efflusso di inibitori delle tirosino chinasi (TKI) anti BCR-ABL (es.imatinib, Dasatinib, Nilotinib, aurora kinasi inibitori, etc) nella cellula leucemica Ph+ (hOCT1, trasportatori ABC) nell'ambito della farmacoresistenza emersa nei trials clinici sperimentali in corso a livello nazionale ed internazionale ai quali il proponente partecipa. Questi studi sono rivolti ad indagare se queste molecole possano rappresentare validi bersagli per una terapia maggiormente mirata sulle cellule staminali leucemiche ("cancer stem cell therapy"). 2. Caratterizzazione dei meccanismi che concorrono all'intrinseca resistenza delle cellule staminali leucemiche agli inibitori delle tirosino-chinasi.  Allo scopo di studiare la sensibilità delle cellule staminali Ph+ all'azione degli inibitori delle tirosino-chinasi da soli e in sequenza, verranno compiuti sia studi in vitro che studi ex-vivo. Tali studi comprendono a) valutazione della percentuale di cellule Ph+ mediante fluorescence in situ hybridization (FISH); b) determinazione della quantità di trascritto BCR-ABL (che verrà poi comparata con quella misurata sulle cellule mononucleate totali) mediante real-time RT-PCR; c) screening per la presenza di mutazioni puntiformi nel gene Abl, mediante subclonaggio del dominio tirosino-chinasico in un vettore batterico e successivo sequenziamento; d) profilo di espressione genica globale mediante cDNA microarrays (Affymetrix); e) profilo di espressione di micro-RNA mediante chip specifici. 3. Creazione di una banca preziosa di campioni biologici, ottenuti dopo consenso scritto informato del paziente, processati e conservati prima dell'inizio della terapia e successivamente durante il trattamento ad intervalli di tempo regolari e di dati clinici, registrati accuratamente in formato elettronico, per effettuare correlazioni tra i risultati biologici e la risposta clinica. Promozione di trials clinici con case farmaceutiche (vedi collaborazioni) e con studi spontanei (AIFA) con monitoraggio molecolare della risposta clinica. Identificazione di meccanismi di farmacoresitenza, nuovi oncogeni, nuove procedute diagnostiche -terapeutiche ed elaborazione di trials clinici di ricerca clinica sperimentale su base internazionale e nazionale. 4. Analisi genomica ad alta risoluzione. L'utilizzo della piattaforma Affymetrix GeneChip Mapping 500K SNP array per l'analisi genetica su ampia scala nella LAL Ph-positiva e nella LMC in crisi blastica consentirà di identificare a livello microscopico, lesioni genetiche non identificabili mediante citogenetica convenzionale e responsabili del meccanismo di leucemogenesi e dello sviluppo della resistenza agli inibitori tirosino-chinasici, fornendo nuove opportunità per lo sviluppo di terapie molecolari mirate. 5. Studiare i meccanismi responsabili della formazione di alterazioni genetiche mediante la ricerca di sequenze consenso fiancheggianti i punti di rottura sul DNA. Tale approccio consentirà di spiegare la formazione di alterazioni genetiche e di eventualmente identificare dei farmaci in grado di agire contro tali bersagli. 6. Correlare le alterazioni genetiche alla risposta clinica, in modo da identificare efficaci biomarcatori di risposta e progressione. 7. Sperimentazione in vitro e in modelli pre-clinici di nuovi inibitori e più in generale di nuove strategie terapeutiche. Verranno testate diverse strategie inibitorie che agiscano a livello dei meccanismi chiave che sono alla base della trasformazione neoplastica, ossia induzione della proliferazione cellulare, inibizione dell'apoptosi, inibizione del differenziamento. In particolare, si sperimenterà: a) inibitori del DNA repair (PARP inibitors; HMDM2 inhibitors; Chk1 e Chk2 inhibitors)  attivi in studi in vitro contro il pathways del DNA repair e potenzialmente utili per studi in clinica sulle leucemie acute e sulle staminali leucemiche; b) inibitori del Wnt/ β catenin pathway e dello Smo signaling o Hedgehog signaling, o Notch1 signaling (nelle T ALL) che sono coinvolti nel self-renewal delle cellule staminali; c) protocollo di terapia di prima linea delle LMC con due inibitori delle tirosino-chinasi (nilotinib e imatinib) somministrati in rotazione; d) protocollo di terapia di prima linea della leucemia acuta linfoblastica Ph+ con un inibitore delle tirosino-chinasi di seconda generazione (nilotinib). 8. Identificare possibili mutazioni alla diagnosi e alla ricaduta responsabili della leucemia e valutare il loro ruolo come possibili marcatori per la malattia minima. Tale approccio consentirà di identificare nuovi potenziali marcatori da utilizzare per il monitoraggio della malattia minima residua. Verrà utilizzata un"whole-transcriptome sequencing" (mediante l'utilizzo di un sequenziatore di ultima generazione, ossia della piattaforma Solexa, Illumina http://www.cd-genomics.com/gene/solexa.htm e Roche diagnostics Junior 454) per valutare il tasso mutazionale globale. 9. Chiarire il ruolo di Abl nella traduzione del segnale da parte di integrine e recettori per agenti chemiotattici in leucociti mieloidi e cellule BCR-ABL+ ed in particolare definire in dettaglio le componenti di un modulo di trasduzione del segnale basato su chinasi della famiglia del Src e Abl ed implicato nella regolazione del movimento, polarizzazione e sopravvivenza cellulare. Tale obiettivo si propone di identificare nuovi possibili bersagli farmacologici per il controllo della leucemogenesi.