Davide Roncarati

Tra i più diffusi ed importanti patogeni umani, Helicobacter pylori è un batterio gram-negativo in grado di colonizzare la nicchia gastrica umana e la cui presenza è stata associata con lo sviluppo di patologie dell'apparato gastro-intestinale di varia gravità.  Tra i diversi fattori che consentono al microrganismo di attuare un'infezione efficace e persistente, le proteine chaperone sono certamente di primaria importanza, in quanto consentono ad H. pylori di far fronte alle condizioni particolarmente avverse dello stomaco umano. Due regolatori trascrizionali, HrcA e HspR, sono responsabili del controllo dell'espressione delle principali proteine heat-shock in H. pylori attraverso un circuito di regolazione fine e complesso, che include meccanismi di controllo sia a livello trascrizionale sia post-trascrizionale. Un altro aspetto chiave, coinvolto nel controllo della virulenza, così come di altri processi cellulari essenziali, è la regolazione dell'omeostasi intracellulare dei metalli. Due regolatori trascrizionali, Fur e NikR, sono coinvolti nel controllo dell'espressione genica in modo metallo-dipendente, rispettivamente in risposta a ferro e nichel.

Il nostro obiettivo è quello di far luce sui diversi circuiti di regolazione descritti, con un approccio sperimentale che integri tecniche molecolari, biochimiche e genomiche, in modo tale da ottenere una visione d'insieme il più possibile completa del sistema d'interesse. I risultati ottenuti serviranno a chiarire ulteriormente i meccanismi di base che consentono ad H. pylori di sopravvivere nella nicchia gastrica e di diffondersi nella popolazione umana. 

Helicobacter pylori, un batterio gram-negativo, spirilliforme e microaerofilo, è stato isolato e descritto per la prima volta nel 1983 da una biopsia gastrica. Tale patogeno colonizza la mucosa gastrica umana ed è considerato l'agente eziologico di diverse patologie del tratto gastrointestinale, quali gastriti croniche attive, ulcere e gastriti duodenali ed è considerato un fattore di rischio per lo sviluppo di adenocarcinoma. Diversi fattori di virulenza contribuiscono al positivo esito del processo di infezione e colonizzazione dell'epitelio gastrico: tra questi i più importanti sono l'enzima ureasi, l'apparato flagellare, la tossina vacuolizzante VacA, la citotossina CagA, diversi meccanismi di mimetismo molecolare che consentono al batterio di eludere la risposta immunitaria dell'ospite; altri fattori di primaria importanza sono la regolazione dell'omeostasi dei metalli e la proteina chaperones.

La determinazione della sequenza genomica di diversi isolati clinici ha fornito informazioni sulla biologia del batterio, e molti sforzi sono stati focalizzati su aspetti di diretta rilevanza patologica. I geni che codificano per l'apparato trascrizionale di base sono stati identificati, suggerendo che il processo di trascrizione in H. pylori è simile a quello di altri batteri Gram-negativi. Di contro, il fattore sigma della fase stazionaria (sigma-S) e il fattore sigma per l'heat shock (sigma-32) mancano nel genoma, e solo pochi regolatori trascrizionali sono annotati. Questo aspetto è di primaria rilevanza per l'infezione batterica, perché l'espressione dei fattori di virulenza è spesso stimolata a livello trascrizionale da stress ambientali, inclusa la limitazione di cofattori essenziali quali i metalli, condizioni sfavorevoli di pH, stress osmotico e ossidativo.

Le proteine heat-shock di H. pylori sono state studiate dettagliatamente sia per il loro ruolo nella protezione del patogeno dall'ambiente ostile dello stomaco umano, sia per un loro ipotizzato coinvolgimento in specifici processi patogenici. In particolare, gli omologhi della chaperonina GroELS sono considerati importanti modulatori della stabilità e dell'attività dell'enzima ureasi, che protegge il batterio dal basso pH dello stomaco, ed entrambe le proteine DnaK e GroEL sembrano coinvolte nell'adesione del batterio ai glicolipidi presenti sulla superficie delle cellule epiteliali. Generalmente, l'espressione dei geni heat-shock è finemente regolata, con un livello basale che assicura le funzioni cellulari in condizioni di crescita normali ed una forte induzione dell'espressione in seguito all'esposizione a diversi stress ambientali come ad esempio shock termico, shock acidico od osmotico, esposizione a solventi organici o a metalli pesanti. Nonostante i meccanismi di risposta a stress sono largamente conservati sia tra i procarioti che tra gli eucarioti, i meccanismi di regolazione dell'espressione di questi effettori variano considerevolmente tra specie batteriche diverse. Un meccanismo di regolazione positiva si osserva in Escherichia coli ed in altri batteri gram-negativi: in questi casi un fattore sigma specifico (sigma-32) induce la trascrizione dei geni heat-shock in condizioni di stress. In Bacillus subtilis ed in altri gram-positivi e -negativi la regolazione è di tipo negativo e si basa sull'azione di un repressore trascrizionale chiamato HrcA, il quale lega le regioni promotrici dei geni heat-shock in condizioni normali, reprimendone in tal modo l'espressione; in condizioni di stress, si osserva il distacco di tale repressore. Una variante di tale meccanismo si osserva in Streptomyces : in questo caso il repressore HspR, non correlato ad HrcA, controlla la trascrizione dell'operone contenente dnaK . Il sequenziamento del genoma di diversi ceppi di H. pylori ha evidenziato l'assenza del fattore sigma specifico per l'heat shock sigma-32 e la presenza di omologhi di entrambi i repressori appena descritti (HrcA e HspR). In questo contesto, siamo stati in grado di dimostrare che la trascrizione dei tre operoni contenenti i geni codificanti le principali proteine chaperone di H. pylori è regolata negativamente da uno o entrambi i repressori. In particolare, la trascrizione dell'operone cbpA-hspR-helicasi è repressa solamente da HspR, mentre la trascrizione degli operoni groES-groEL e hrcA-grpE-dnaK è negativamente regolata da entrambi i repressori: inoltre, entrambi i regolatori sono necessari per avere repressione degli operoni co-regolati. Saggi di DNaseI footprinting hanno consentito di identificare i siti di legame dei due repressori sui tre diversi promotori: i nostri dati indicano che i due repressori, sui promotori co-regolati, legano operatori distinti, separati da poche decine di nucleotidi, senza interagire direttamente fra loro ed in maniera indipendente. Il circuito di regolazione appena descritto appare ancor più complesso se si considera il ruolo svolto dalla chaperonina GroESL. In diverse speci batteriche, l'attività di legame dei repressori heat-shock è stimolata dalle proteine chaperone che essi stessi regolano. I risultati da noi conseguiti suggeriscono che la chaperonina GroESL interagisce direttamente con HrcA, e forse con HspR, e ne aumenta l'affinità di legame per gli operatori da loro contattati, contribuendo in tal modo alla repressione trascrizionale dei promotori regolati. In accordo con il cosidetto ‘titration model' proposto per Bacillus subtilis , la chaperonina GroESL potrebbe interagire con HrcA di H.pylori per favorirne il corretto ripiegamento ed aumentarne la capacità di legare il DNA, contribuendo in tal modo alla repressione trascrizionale dei promotori target. In  presenza di stimoli di stress, invece, la chaperonina GroESL verrebbe sequestrata da livelli crescenti di proteine cellulari denaturate, rimuovendo in tal modo la repressione trascrizionale dei geni heat-shock, mediata da HrcA. Parallelamente all'analisi di questo complesso circuito di regolazione dei geni heat-shock, abbiamo anche analizzato le funzioni regolative di HrcA e HspR a livello genomico attraverso l'utilizzo di macroarrays. Attraverso l'analisi del trascrittoma di ceppi mutanti per un o entrambi i regolatori, comparato a quello del ceppo wild-type, è stato possibile identificare in totale 43 geni significativamente up- o down-regolati nei mutanti rispetto al wt. Il dato più interessante riguarda il fatto che la maggioranza dei geni positivamente regolati possiede promotori trascritti da polimerasi contenenti il fattore sigma alternativo sigma-54 o sigma-28 e che la maggioranza di questi geni codifica per proteine coinvolte nella biosintesi o regolazione dell'apparato flagellare. In accordo con questi dati, i ceppi mutanti per hrcA e hspR risultano essere non motili. Dal momento che non si osserva legame di HrcA e/o HspR sui promotori di alcuni di questi geni, riteniamo che la regolazione osservata avvenga attraverso un meccanismo indiretto. Un'ipotesi plausibile potrebbe essere che l'induzione delle proteine chaperone alteri l'assemblaggio dell'apparato flagellare e/o aumenti l'attività di fattori anti-sigma specifici, come ad esempio FlgM, che di conseguenza potrebbe innescare una regolazione negativa a feedback della trascrizione  programmata dei geni per la motilità.

In collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Zanotti dell'Università di Padova, siamo interessati alla caratterizzazione strutturale dei repressori dei gene heat-shock HrcA e HspR.

Il ruolo del ferro come elemento essenziale in processi come il trasporto elettronico, il metabolismo energetico e la sintesi di DNA nei batteri è ben documentato, e geni coinvolti nel metabolismo del ferro in H. pylorisono importanti per la patogenesi. Un altro metallo importante per H. pylori è il nichel ed il suo ruolo nell'attivazione di due enzimi contenenti nichel, ureasi e idrogenasi, entrambi necessari per una efficiente colonizzazione. L'ureasi permette la neutralizzazione dell'ambiente altamente acido attraverso la conversione dell'urea in ammonio e bicarbonato, mentre l'idrogenasi permette una efficiente colonizzazione dello stomaco attraverso l'ossidazione dell'idrogeno che è disponibile nella nicchia gastrica. In H. pylori sono stati identificati solo due regolatori trascrizionali coinvolti nell'omeostasi di metalli: un omologo della proteina batterica Fur, ed un omologo del repressore NikR che in E. coli controlla l'espressione di una permeasi del nichel. Fra i regolatori che mediano risposte ambientali sono inclusi quattro istidine-chinasi con i loro regolatori di risposta associati e due regolatori di risposta orfani. Tuttavia, i geni bersaglio regolati da questi sistemi a due componenti sono largamente sconosciuti. La poca abbondanza dei regolatori identificati nel genoma è stata interpretata come dovuta all'adattamento di H. pylori alla sua nicchia molto ristretta nello strato mucoso del lume dello stomaco e come mancanza di competizione da parte di altri microrganismi. Tuttavia, sembra che H. pylori utilizzi complessi meccanismi di controllo della trascrizione dei geni. Esempi sono rappresentati dal regulone heat shock, che è controllato dall'azione combinata dei repressori HspR e HrcA, e dal regolatore Fur che, attraverso un complesso meccanismo di repressione e derepressione, controlla sia geni repressi che indotti da ferro. Fur è stato anche coinvolto nella resistenza a condizioni di acidità e induzione da nichel dei geni dell'ureasi, ed è stato mostrato che i suoi geni bersaglio rispondono a segnali diversi dal ferro, indicando che il suo ruolo di regolatore trascrizionale potrebbe espandersi al di fuori del solo metabolismo del ferro.

Dall'identificazione di un elemento cis-agente richiesto per l'induzione dei geni dell'ureasi in presenza di eccesso di nichel è stato proposto che NikR fosse il regolatore di questa induzione. Inoltre, studi di trascrittomi hanno identificato un set di geni deregolati in mutanti di delezione di nikR, alcuni dei quali sono stati recentemente trovati deregolati in mutanti di delezione di fur. Due regolatori sono, pertanto, coinvolti nel controllo dell'espressione genica in modo metallo-dipendente e sembrano essere coinvolti nella regolazione di insiemi sovrapposti di geni in H. pylori, inclusi i geni dell'ureasi. Recentemente è stato dimostrato che i due regolatori, Fur e NikR, possono legare indipendentemente operatori distinti o competere per operatori sovrapposti in alcuni promotori di geni coregolati. Inoltre, un doppio mutante Fur-NikR è attenuato nel modello del topo, enfatizzando il legame tra risposta all'acidità, metabolismo dei metalli, e virulenza di questo patogeno gastrico. Data la sua importanza nella resistenza a stress acido, non è sorprendente che la trascrizione dei geni dell'ureasi, ureAB, insieme ad altri geni codificanti componenti, o vie alternative per la produzione di ammonio, è indotta anche da pH acido. Si pensa che la solubilità del nichel, e quindi la sua disponibilità intracellulare, aumenti a basso pH. Di conseguenza è stato speculato che NikR potrebbe agire come un regolatore principale per l'adattamento in condizioni acide attraverso attivazione diretta della trascrizione dei geni ureAB, e attivazione di altri geni regolati da pH, attraverso una cascata di regolatori trascrizionali che coinvolge il repressore Fur. Tuttavia, è stato chiaramente dimostrato che l'induzione della trascrizione da pH acido di ureAB richiede il sistema a due componenti ArsRS. Questo sistema comprende il regolatore OmpR-simile di risposta ArsR,che è un gene essenziale, e l'istidina-chinasi non essenziale ArsS e controlla la trascrizione di diversi geni di H. pylori in risposta a pH acido. Di conseguenza, i due regolatori trascrizionali di risposta a metalli, NikR e Fur, ed il regolatore di risposta ArsR controllano la trascrizione in risposta a condizioni di acidità in H. pylori. In supporto di questa ipotesi, è stato riportato che i regolatori NikR e ArsR legano siti sovrapposti localizzati a monte del promotore dell'ureasi, suggerendo un complesso meccanismo di regolazione in risposta a pH e nichel.

Malgrado questi lavori, i meccanismi molecolari utilizzati da NikR e ArsR per il controllo della regolazione genica rimangono da stabilire. Per esempio, non è chiaro se il ruolo di NikR di H. pylori è soltanto come repressore della trascrizione in risposta al nichel, come la proteina NikR di E. coli, o se può anche attivare la trascrizione in modo diretto o indiretto. Anche nel caso di Fur, il cui modo d'azione è stato studiato più in dettaglio, il meccanismo per il quale l'affinità cambia per i diversi operatori in accordo allo stato del ferro del regolatore rimane da scoprire. Inoltre, i diretti bersagli di Fur, NikR, ed ArsR devono essere verificati per discriminare tra un controllo trascrizionale autentico ed effetti pleiotropici indiretti e/o da circuiti di regolazione intermedi. Pertanto, il nostro scopo è di condurre un'analisi approfondita di questi regolatori di H. pylori per chiarire a livello molecolare i loro meccanismi di azione e le loro risposte a segnali ambientali. Informazioni dettagliate sul controllo della regolazione sono fondamentali per capire come le interconnessioni tra i circuiti di NikR, Fur ed ArsR permettono ad H. pylori di stabilire con successo l'infezione nella nicchia gastrica e divenire patogenico.