Argomenti di tesi proposti dal docente.
- Studio del meccanismo di reazione della Tirosin-fosfatasi Mptpa di Mycobacterium tuberculosis.
La Tirosin-fosfatasi di Mycobacterium tubeculosisè una piccola proteina (17 kDa) la cui azione catalitica non è finora stata studiata in dettaglio. Presso il nostro gruppo di ricerca tale proteina è stata sovraespressa in Escherichia colie purificata mediante tecniche cromatografiche. Una prima caratterizzazione cinetica ha messo in evidenza come l’enzima sia attivabile da parte del proprio substrato e sia soggetto a transizioni allosteriche. Inoltre, per facilitare l’analisi del meccanismo catalitico e della attivazione da substrato sono già stati costruiti due mutanti sito specifici: i) la variante W152F, la cui struttura primaria contiene un solo triptofano (W48); ii) il doppio mutante C11S, W152F nel quale la sostituzione della cisteina catalitica (C11) comporta una totale perdita di attività. La presenza di un singolo triptofano nei due suddetti mutanti permette di studiare, mediante spettroscopia di fluorescenza, la dinamica del sito attivo durante la catalisi. Inoltre, mediante il doppio mutante C11S, W152F è possibile analizzare l’associazione dell’enzima al substrato (o ad altri ligandi) in assenza di catalisi.
Il presente Progetto di Tirocinio curriculare e Tirocinio per Tesi si propone di analizzare i primi stadi del ciclo catalitico dell’enzima, compreso il legame del substrato o di potenziali inibitori. Si prevede inoltre di costruire ulteriori mutanti (in particolare sostituendo il triptofano 48) per indagare in particolare la chiusura del sito attivo successiva al legame del substrtato.
Tirocinio curriculare (10 cfu) e Tirocinio per Tesi (24 cfu).
Laboratorio del Prof. Alejandro Hochkoeppler.
(Tel.: 051 2093671, e-mail: [mailto:a.hochkoeppler@unibo.it])
- Sovraespressione e purificazione della lattato deidrogenasi umana.
La natura allosterica della lattato deidrogenasi di muscolo di coniglio è oggetto di discussione e di recentissime indagini riguardo alla influenza della temperatura nei confronti dei riarrangiamenti conformazionali dell’enzima (Katava et al., 2017, Scientific Reports, 7: 41092). Nel corso del 2018 il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato con analisi in steady-state e pre-steady-state che l’enzima di muscolo di coniglio è allosterico. Indagini attualmente in corso hanno permesso di evidenziare un comportamento analogo da parte dell’enzima umano. Si propone pertanto un Tirocinio curriculare il cui obiettivo è la costruzione di un gene sintetico codificante la lattato deidrogenasi umana, nonché la sovraespressione in Escherichia colie la purificazione dell’enzima.
Tirocinio curriculare (10 cfu).
Laboratorio del Prof. Alejandro Hochkoeppler.
(Tel.: 051 2093671, e-mail: [mailto:a.hochkoeppler@unibo.it])
- Analisi delle transizioni allosteriche nella lattato deidrogenasi umana.
La natura allosterica della lattato deidrogenasi di muscolo di coniglio è oggetto di discussione e di recentissime indagini riguardo alla influenza della temperatura nei confronti dei riarrangiamenti conformazionali dell’enzima (Katava et al., 2017, Scientific Reports, 7: 41092). Nel corso del 2018 il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato con analisi in steady-state e pre-steady-state che l’enzima di muscolo di coniglio è allosterico. Indagini attualmente in corso hanno permesso di evidenziare un comportamento analogo da parte dell’enzima umano. Si propone pertanto un Tirocinio curriculare e un Tirocinio per Tesi il cui obiettivo è la individuazione di residui dell’enzima coinvolti nelle transizioni allosteriche. A tale scopo si prevede la costruzione di mutanti sito-specifici della lattato deidrogenasi umana, nonché la loro sovraespressione in Escherichia colie successiva purificazione mediante tecniche cromatografiche.
Tirocinio curriculare (10 cfu) e Tirocinio per Tesi (24 cfu).
Laboratorio del Prof. Alejandro Hochkoeppler.
(Tel.: 051 2093671, e-mail: [mailto:a.hochkoeppler@unibo.it])
- Analisi della stabilizzazione della lattato deidrogenasi indotta dal trealosio.
Il trealosio è un disaccaride (a-D-glucopiranosil-a-D-glucopiranosio) la cui azione stabilizzante nei confronti delle proteine è nota da tempo. Tuttavia, un aspetto non sufficientemente indagato è rappresentato dalla capacità del trealosio di stabilizzare la struttura quaternaria di enzimi. La struttura quaternaria della lattato deidrogenasi di muscolo di coniglio (un omotetramero) è suscettibile di dissociazione a pH leggermente acidi. Tale dissociazione comporta perdita di attività e la formazione di aggregati ad elevata massa molecolare. Indagini prelimanri condotte nel nostro Laboratorio hanno permesso di dimostrare la stabilizzazione della lattato deidrogenasi di coniglio in condizioni di pH acido (5), in presenza di trealosio 0.3-0.9 M. Il presente Progetto di Tirocinio curriculare e Tirocinio per Tesi si propone di approfondire gli aspetti molecolari della stabilizzazione della lattato deidrogenasi indotta dal trealosio e di confrontare l’azione di quest’ultimo con quella di altri disaccaridi di cui sia nota un’azione stabilizzante nei confronti delle proteine (ad esempio il saccarosio).
Tirocinio curriculare (10 cfu) e Tirocinio per Tesi (24 cfu).
Laboratorio del Prof. Alejandro Hochkoeppler.
(Tel.: 051 2093671, e-mail: [mailto:a.hochkoeppler@unibo.it])
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Tesi di Laurea Magistrale
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