Luisa Iommarini

A) CdS LT in Genomics:

Progetto 1 - Validazione di dati di proteomica differenziale per l’identificazione di nuovi interattori del complesso I della catena respiratoria e la determinazione dei meccanismi di risposta alla sua ablazione.

Il complesso I (CI) della catena respiratoria è il più grande complesso multiproteico del sistema OXPHOS, composto da 45 subunità, codificate dal DNA nucleare o mitocondriale. CI può associarsi con CIII e CIV, formando "supercomplessi" (SC), ma i percorsi di assemblaggio di CI o SC sono ancora controversi. In un precedente studio abbiamo studiato la biogenesi di CI e SCs in modelli cellulari privi di due subunità strutturali CI essenziali, ovvero il ND1 codificato del mtDNA, situato nel braccio della membrana, e il nDNA codificato NDUFS3, nel braccio della matrice. Questi esperimenti ci hanno permesso di identificare piccole quantità di SC anche in cellule che mancano di queste subunità necessarie per l’assemblaggio del CI. In questi modelli abbiamo anche effettuato degli esperimenti di proteomica differenziale quantitativa mediante SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture) al fine di indentificare nuovi interattori di CI con un possibile ruolo come fattori di assemblaggio nelle prime fasi della biogenesi del CI. Questi candidati risultano essere coinvolti in alcune vie metaboliche mitocondriali. Lo scopo di questo progetto è quello di validare i dati di proteomica e di comprendere il ruolo di tali interattori nel processo di assemblaggio del CI e dei SC, nonché di identificare la funzione di proteine mitocondriali che vengono sovraespresse in seguito alla mancanza del CI.

Progetto 2 - Analisi di esomi in pazienti affetti da malattie mitocondriali per l'identificazione di nuovi geni e varianti patogene (Correlatore Dr. Leonardo Caporali – Laboratorio di Neurogenetica - IRCCS Istituto delle Scienze Neurologiche di Bologna)

Progetto 3 - Approcci di NGS per lo studio delle varianti del mtDNA a bassa eteroplasmia (Correlatore Dr. Leonardo Caporali – Laboratorio di Neurogenetica - IRCCS Istituto delle Scienze Neurologiche di Bologna)

B) CdS LM in Biotecnologie Farmaceutiche, Biotecnologie Molecolari e Industriali e Biologia Molecolare e Cellulare

Progetto 1 – Meccanismi di sopravvivenza in cellule tumorali difettive per la fosforilazione ossidativa (Porcelli - Iommarini)

Le cellule cancerose sono caratterizzate da meccanismi di adattamento cellulare per garantirne la sopravvivenza anche in condizioni di paucità di nutrienti e ossigeno. In questo contesto, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che le cellule tumorali in cui il complesso I (CI) della catena respiratoria è disassemblato non sono in grado di adattarsi all’ipossia perché le modificazioni metaboliche indotte dalla carenza del CI impediscono la stabilizzazione del fattore indotto da ipossia (HIF1) anche in condizioni ipossiche. Tuttavia, dopo un periodo di adattamento, tali cellule sono comunque in grado di formare delle masse tumorali, sebbene in tempi molto più lunghi rispetto alla loro controparte wild type e sebbene tali tumori siano morfologicamente molto differenti. Lo scopo di questo progetto è quello di studiare i possibili meccanismi molecolari che permettono la sopravvivenza delle cellule tumorali difettive per il CI. In particolare, saranno analizzati i seguenti meccanismi:

(i) la via di segnalazione mediata da PI3K/Akt che è nota promuovere attivare dei meccanismi di sopravvivenza e che abbiamo trovato attivata nelle cellule e nei tumori deficitari per il CI. In questi modelli sarà studiata questa via di segnalazione tramite analisi della fosforilazione di numerose proteine bersaglio e l’uso di specifici inibitori di questa via di segnalazione intracellulare al fine di dimostrare che la sua inattivazione porta all’eradicazione delle cellule tumorali

(ii) l’autofagia, ed in particolare la mitofagia, meccanismo noto per permettere la sopravvivenza cellulare in caso di privazione di nutrienti tramite il riciclo dei componenti cellulari e che è finemente regolato in relazione alla disponibilità di nutrienti e alla carica energetica intracellulare

(iii) Lo stress del reticolo endoplasmatico e l’accumulo di lipid droplets in cellule prive di CI

Progetto 2 – Studio del setting metabolico di cellule di carcinoma ovarico in relazione alla resistenza alla chioterapia (Porcelli - Iommarini)

Le cellule di carcinoma ovarico sono state recentemente classificate in base alle loro caratteristiche metaboliche in high e low-OXPHOS e il metabolismo correlato alla chemoresistenza. Dato che i principali regolatori del metabolismo glicolitico e ossidativo sono rispettivamente il fattore di trascrizione HIF1a e il coattivatore trascrizionale PGC-1a, questo progetto mira a studiare il loro coinvolgimento nella risposta ai chemioterapici al fine di identificare i determinanti molecolari della chemoresistenza nel contesto del carcinoma ovarico.

Progetto 3 - Validazione di dati di proteomica differenziale per l’identificazione di nuovi interattori del complesso I della catena respiratoria e la determinazione dei meccanismi di risposta alla sua ablazione.

Il complesso I (CI) della catena respiratoria è il più grande complesso multiproteico del sistema OXPHOS, composto da 45 subunità, codificate dal DNA nucleare o mitocondriale. CI può associarsi con CIII e CIV, formando "supercomplessi" (SC), ma i percorsi di assemblaggio di CI o SC sono ancora controversi. In un precedente studio abbiamo studiato la biogenesi di CI e SCs in modelli cellulari privi di due subunità strutturali CI essenziali, ovvero il ND1 codificato del mtDNA, situato nel braccio della membrana, e il nDNA codificato NDUFS3, nel braccio della matrice. Questi esperimenti ci hanno permesso di identificare piccole quantità di SC anche in cellule che mancano di queste subunità necessarie per l’assemblaggio del CI. In questi modelli abbiamo anche effettuato degli esperimenti di proteomica differenziale quantitativa mediante SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture) al fine di indentificare nuovi interattori di CI con un possibile ruolo come fattori di assemblaggio nelle prime fasi della biogenesi del CI. Questi candidati risultano essere coinvolti in alcune vie metaboliche mitocondriali. Lo scopo di questo progetto è quello di validare i dati di proteomica e di comprendere il ruolo di tali interattori nel processo di assemblaggio del CI e dei SC, nonché di identificare la funzione di proteine mitocondriali che vengono sovraespresse in seguito alla mancanza del CI.

Progetto 4 - Nuovi approcci massivi per la definizione genetica di pazienti con patologie neurologiche rare (Correlatore Dr. Leonardo Caporali – Laboratorio di Neurogenetica - IRCCS Istituto delle Scienze Neurologiche di Bologna)

Definizione del difetto genetico in pazienti con patologie neurologiche, tra cui atrofia ottica, oftalmoplegia esterna progressiva cronica (CPEO), encefalomiopatie mitocondriali, encefalopatie epilettiche, Parkinson a esordio giovanile, Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) e casi di pazienti con malattie neurologiche ereditarie non risolti. Considerando l’eterogeneità genetica alla base di queste malattie, e all’esperienza maturata, sui pazienti con sospetto genetico verrà effettuato l’analisi dell’intero esoma (WES), prioritizzando per le varianti in geni associati alla specifica patologia e/o in base ai sintomi principali e secondari (HPO terms). Nei casi negativi all’analisi dell’esoma, verrà applicato un protocollo integrato, ove possibile, che comprende l’analisi dell’intero genoma (WGS), del trascrittoma (RNA-seq), del proteoma e del metaboloma sul tessuto target o linee cellulari derivanti dal paziente. Nei pazienti in cui si sospettano riarrangiamenti genetici di dimensioni intermedie, non individuabili con tecniche di sequenziamento NGS o con CGH-array, sarà eseguito l’analisi dell’intero genoma mediante sequenziamento con long-reads. Con lo stesso approccio, verranno caratterizzati i riarrangiamenti del genoma mitocondriale nelle biospie muscolari dei pazienti affetti da mipoatia mitocondriale, al fine di individuare possibili duplicazioni/insersioni non individualizzabili con le tecniche NGS.

C) TESI ALL’ESTERO CdS LM in Biotecnologie Farmaceutiche, Biotecnologie Molecolari e Industriali e Biologia Molecolare e Cellulare:

Progetto 1 (Université Claude Bernard Lyon - Lione – Francia) – Controllo genetico della biosintesi dei recettori dell’acetilcolina: da C. elegans alle malattie umane (Correlatore Dott.ssa Manuela D'Alessandro) (sono disponibili finanziamenti per il periodo di tirocinio)

I recettori ionotropi dell'acetilcolina (AChR) sostengono la neurotrasmissione alla giunzione neuromuscolare e hanno una funzione neuromodulatoria nel sistema nervoso centrale. La disfunzione di questi recettori è legata a diverse patologie, tra cui miastenia, schizofrenia o epilessia. La quantità di recettori presenti sulla membrana plasmatica è finemente regolata e risulta da un equilibrio tra biosintesi, riciclo e degradazione. La nostra ricerca mira a identificare e caratterizzare nuovi fattori coinvolti nella biosintesi dell'AChR. La nostra strategia consiste in: 1. identificare nuovi fattori coinvolti nella biosintesi dell'AChR usando l'organismo modello Caenorhabditis elegans, 2. caratterizzare la funzione di questi fattori in C. elegans, 3. testare la conservazione della funzione in linee cellulari umane, 4. data mining per polimorfismi nei geni identificati che potrebbero essere associati a malattie umane; se applicabile, introdurre gli stessi polimorfismi nel genoma di C. elegans per testare la potenziale patogenicità della mutazione umana. Durante lo stage, lo studente caratterizzerà due proteine, TMED7 e TMED2, che sono state identificate da uno screening genetico condotto in C. elegans. TMED7 e TMED2 sono coinvolte nel trasporto mediato dal reticolo endoplasmatico al Golgi. Fino ad ora, non sono mai stati collegati alla biosintesi di AChR. I nostri dati preliminari mostrano che la quantità di AChR alla giunzione neuromuscolare è ridotta di oltre il 50% nei mutanti per TMED7 o TMED2.

Più specificamente lo studente:

1. confermerà i dati preliminari attraverso l'imaging dei recettori marcati endogenamente con t-RFP nei mutanti TMED con un sistema confocale spin disc, AChR Biosynthesis C. elegans
2. identificherà e caratterizzerà i seguenti modelli. Linee cellulari di mammiferi: conservazione Pazienti: polimorfismi - determinare la localizzazione subcellulare di TMED7 e TMED2 modificando il genoma di C. elegans utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9 per inserire un tag fluorescente nei loci che codificano le proteine, - partecipare al knock-out di TMED7 e TMED2 mediante CRISPR/Cas9 in linee cellulari umane e caratterizzare i livelli di AChR in queste cellule,
3. cercherà i polimorfismi dei pazienti TMED7 e TMED2 utilizzando database e biobanche per malattie rare, ed eventualmente introdurli nel genoma di C. elegans per testarne la patogenicità. Lo studente lavorerà sotto la supervisione di due ricercatori permanenti

I candidati devono avere ottimi risultati accademici ed essere motivati ed entusiasti. Non è richiesta una precedente esperienza con C. elegans. Chiediamo ai candidati di inviare un CV e una lettera di motivazione di una pagina (in francese o in inglese; la lettera deve spiegare l'interesse del candidato nel progetto) a manuela.d-alessandro@univ-lyon1.fr.

Progetto 2 (UCL London – UK) - Generazione di modelli in vitro di malattie mitocondriali primarie (Correlatore Dott.ssa Micol Falabella)

Le malattie mitocondriali primarie (PMD) sono disturbi genetici causati da mutazioni nel DNA nucleare o nel DNA mitocondriale (nDNA/mtDNA) che compromettono la produzione di energia mitocondriale e altri aspetti del metabolismo cellulare. Sono tra le più comuni malattie neurologiche ereditarie e sono associate a gravi disabilità e a una riduzione della durata della vita. Attualmente non esiste un trattamento efficace e la gestione clinica si concentra sul trattamento delle complicanze. Esiste quindi un bisogno urgente e insoddisfatto di sviluppare nuovi trattamenti con un'alta probabilità di successo negli studi di efficacia clinica. Questo progetto si concentrerà sulla generazione di modelli in vitro di PMD clinicamente rilevanti per testare piccole molecole terapeutiche. Un progetto in quest'area di ricerca delle neuroscienze fornirà una formazione specialistica in biologia mitocondriale e bioenergetica, oltre a un'ampia formazione in approcci di biologia cellulare e molecolare.

Progetto 3 (UCL London – UK) - Caratterizzazione di nuovi geni di malattie mitocondriali primarie (Correlatore Dott.ssa Micol Falabella)

I mitocondri sono fondamentali per il metabolismo cellulare e forniscono la principale fonte di energia nelle cellule umane. La disfunzione mitocondriale è un motivo comune di malattie neurodegenerative e neuromuscolari. Questo progetto di master si concentrerà sulla caratterizzazione di mutazioni genetiche rare e nuove che causano la malattia in persone con sospetta malattia mitocondriale, sfruttando i dati del Progetto 100.000 Genomi, per comprendere i meccanismi molecolari alla base della fisiopatologia della disfunzione mitocondriale. A tal fine, il progetto si avvarrà di un'ampia gamma di modelli cellulari clinicamente rilevanti per stabilire l'impatto delle varianti geniche mitocondriali sulla bioenergetica e sul fenotipo clinico. Un progetto in quest'area di ricerca delle neuroscienze fornirà una formazione specialistica in biologia mitocondriale e bioenergetica, oltre a un'ampia formazione in approcci di biologia cellulare e molecolare.