Foto del docente

Maria Gabriella Campadelli

Professoressa emerita

Alma Mater Studiorum - Università di Bologna

Settore scientifico disciplinare: BIO/19 MICROBIOLOGIA GENERALE

Temi di ricerca

Basi molecolari della penetrazione del virus herpes simplex nella cellula

I multivesicular bodies come piattaforma per la fuoriuscita del del virus herpes simplex dalla cellula

 Ingegnerizzazione e attività di Virus herpes simplex oncologici

 



Basi molecolari dell'ingresso del virus herpes simplex (HSV) nella cellula ospite e fuoriuscita del virus dalla cellula infetta

 

Verso la fine degli anni ‘80 il lavoro di Gabriella Campadelli Fiume si è focalizzato sulle basi molecolari dell'ingresso del virus herpes simplex e della sua fuoriuscita dalla cellula, oltre che sulle modificazioni  dei comparti cellulari, quali le vie esocitiche, il citoscheletro, ecc. Il lavoro attuale mira ad applicare le conoscenze acquisite all'ingegnerizzazione di un virus herpes simplex oncolitico re-indirizzato verso i recettori espressi sulle cellule tumorali ed al disegno razionale di inibitori della fusione attivi e specifici contro il virus herpes simplex. Alla fine degli anni ‘80 il laboratorio di Gabriella Campadelli –Fiume ha fornito la prima evidenza di come, tra le numerose glicoproteine che si trovano sull'envelope del virus herpes simplex, gD interagisca con i recettori cellulari che mediano l'ingresso del virus. Nel 1998 il nostro gruppo, insieme ad altri, ha identificato la nectina-1, una molecola di adesione intercellulare, come recettore per gD di HSV, e ne ha caratterizzato l'ortologo murino. gD può anche utilizzare un recettore alternativo, HVEM (Herpesvirus Entry Mediator). Studi recenti hanno evidenziato come gD ricopra anche la funzione di segnalare il riconoscimento del recettore a gB innescando così la fusione. Per esercitare queste due funzioni, l'ectodominio di gD è organizzato in due regioni differenti dal punto di vista topologico e funzionale. La porzione amminoterminale (amminoacidi 1-260 della proteina matura) comprende i siti di legame ai recettori. La porzione carbossiterminale comprende il dominio pro-fusogenico (profusion domain, PFD), necessario per l'innesco della fusione, ma non per il legame con il recettore cellulare. Quest'ultima attività è stata inferita dall'osservazione che gD solubile ripristina l'infettività di un virus deleto di gD, ammesso che sia composta non solo dalla regione che interagisce con il recettore, ma anche dalla regione a valle, almeno fino al residuo 285. Dati biochimici e strutturali indicano chiaramente come le proprietà predominanti del PFD di gD siano la facoltà di legare la porzione amminoterminale della glicoproteina non legata  e la possibilità di essere spiazzata dal proprio sito di legame quando gD interagisce con uno dei suoi recettori. Il modello che ne consegue evidenzia come, nella gD nativa non legata, la regione carbossiterminale  si reclini su se stessa ed avvolga la regione amminoterminale; ciò consente a gD di adottare una conformazione chiusa autoinibita. In seguito al legame di gD con uno dei suoi recettori, l'interazione tra l'amminoterminale ed il carbossiterminale viene meno, il carbossiterminale non è più trattenuto e viene spiazzato dal proprio sito di legame sull'amminoterminale: gD adotta una conformazione aperta. Oltre a gD, l'ingresso di HSV richiede altre tre glicoproteine gB, gH e gL. La chiave per delineare come gD segnali il riconoscimento del recettore alle glicoproteine a valle è stata l'identificazione di un complesso sopramolecolare che si forma tra le quattro glicoproteine in seguito al legame di gD con uno dei recettori. Le glicoproteine vengono reclutate nel complesso seguendo un ordine specifico. gD legata al recettore recluta gB; in seguito il complesso recettore-gD-gB recluta gH.gL. L'assemblaggio del complesso richiede uno dei recettori di gD, sia esso nectina-1 o HVEM.

Esecuzione della fusione: gH e gB

Una ricerca bioinformatica è stata condotta sulle quattro glicoproteine per mezzo di un predittore  basato su reti neurali. E' emerso come gH sia la sola glicoproteina di HSV che abbia nel proprio ectodominio una a-elica altamente idrofobica  (chiamata a-H1) e due heptad repeats (HR-1 e HR-2). Un'accurata caratterizzazione di questi elementi strutturali ha candidato l' a-elica1  ad essere un peptide di fusione. I due heptad repeats interagiscono tra loro formando un coiled coil. Queste proprietà sembrano essere essenziali per governare  il massiccio riarrangiamento strutturale che ha luogo durante la fusione. Recentemente è stata risolta la struttura del cristallo di gB. Essa ha evidenziato come gB sia un trimero dotato di un nucleo a coiled coil  e come, a livello strutturale, sia molto simile alla glicoproteina dell'envelope (G) del virus della stomatite vescicolare (VSV). Questa è un'osservazione sorprendente  poiché  non vi era a priori nessun suggerimento che portasse a pensare che gB avesse la tipica struttura di una glicoproteina fusogenica virale. Al momento lo scenario più verosimile prevede che gH e gB formino un complesso, e che insieme le due glicoproteine agiscano da esecutori della fusione.

Design razionale di inibitori della fusione

L'identificazione di gH come candidato esecutore della fusione in HSV, unitamente alla scoperta che peptidi sintetici che mimano gli heptad repeats inibiscono l'infezione, sono state le basi per un progetto approvato dalla Comunità Europea (operativo da gennaio 2007), chiamato TargetHerpes. Uno degli obiettivi del progetto consiste nell'identificazione di bersagli molecolari per il disegno razionale di chemoterapici antierpetici. (Gabriella Campadelli-Fiume è il Coordinatore Europeo).

I corpi multivescicolari come comparto cellulare per l'assemblaggio del virione di Herpes Simplex per la fuoriuscita dalla cellula

La biogenesi dei corpi multivescicolari (multivesicular bodies, MVB) è topologicamente equivalente alla gemmazione del virione. Perciò diversi virus sfruttano il pathway dei MVB per dotarsi di envelope e fuoriuscire dalla cellula. L'assemblaggio e la fuoriuscita di HSV vengono compromessi quando vengono espresse forme dominati negative di due componenti del  pathway dei MVB Inoltre l'infezione di HSV-1 porta a cambiamenti morfologici dei MVB. gB, una  delle glicoproteine più conservate nella famiglia degli herpesviridae, viene indirizzata alle membrane dei MVB. gB è ubiquitinata sia in cellule infette che trasfettate. L'ubiquitinazione avviene tramite la   lisina63 dell'ubiquitina ,che può determinare l'indirizzamento della proteina (cargo sorting) verso i MVB. Questa linea di ricerca suppone che l'indirizzamento di gB verso i MVB rappresenti un passaggio critico nell'acquisizione dell'envelope di HSV-1 e della sua fuoriuscita dalla cellula, e che membrane modificate di MVB costituiscano una piattaforma per l'acquisizione dell'envelope di HSV-1 nella cellula, o che, in alternativa, componenti dei MVB siano reclutati durante questo processo.

Reindirizzamento del tropismo di HSV verso recettori eterologhi

Le basi molecolari dell'ingresso di HSV nella cellula hanno aperto la strada  per una riuscita modificazione del tropismo di HSV verso recettori eterologhi. Herpes virus sono stati utilizzati come virus oncolitici, principalmente nella cura del glioblastoma. I margini di sicurezza sono stati ampliati debilitando la replicazione virale, facendo in modo che i virus potessero  replicarsi solo nelle cellule proliferanti del tumore, ma non nelle cellule quiescenti neuronali. Questi virus modificati sono stati saggiati in test clinici di fase 1 e 2 con risultati promettenti, anche se gli effetti terapeutici sono inficiati dai bassi livelli di replicazione. L'attuale obiettivo consiste nella realizzazione di un HSV reindirizzato in modo specifico verso i recettori espressi nelle linee tumorali a non nelle cellule sane, in modo da poter utilizzare virus meno debilitati. Roizman e Zhou hanno escogitato una strategia di successo per modificare il tropismo del virus. Essa consiste nell'inserzione di un ligando in gD che consenta alla glicoproteina di rispondere al riconoscimento di un recettore e di innescare la fusione. Negli Stati Uniti sono stati introdotti in gD due ligandi, IL13 e l'urochinasi attivatore del plasminogeno. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha ingegnerizzato un HSV reindirizzato in modo specifico verso il recettore HER2/neu, membro della famiglia EGFR, overespresso nei tumori mammari e dell'ovaio. Circa il 25-30%  dei tumori mammari (quelli con la prognosi più nefasta e con più alta metastaticità) esprimono tale recettore. Poichè HER2/neu non possiede un ligando naturale, il ligando che abbiamo utilizzato è stato un single chain antibody (scFv) diretto contro HER2/neu.

Recentemente sono stati ingegnerizzati  con successo HSV completamente reindirizzati verso HER2 e de-indirizzati dai recettori naturali di HSV, nectina1 e HVEM. Questi virus ricombinanti evidenziano attività oncolitica in vivo, in particolare in topi xeno-trapiantati con tumori umani positivi a HER2