Basi molecolari della penetrazione del virus herpes simplex
nella cellula
I multivesicular bodies come piattaforma per la fuoriuscita del
del virus herpes simplex dalla cellula
Ingegnerizzazione e attività di Virus herpes simplex
oncologici
Basi molecolari dell'ingresso del virus herpes simplex (HSV)
nella cellula ospite e fuoriuscita del virus dalla cellula
infetta
Verso la fine degli anni ‘80 il lavoro di Gabriella Campadelli
Fiume si è focalizzato sulle basi molecolari dell'ingresso del
virus herpes simplex e della sua fuoriuscita dalla cellula, oltre
che sulle modificazioni dei comparti cellulari, quali le vie
esocitiche, il citoscheletro, ecc. Il lavoro attuale mira ad
applicare le conoscenze acquisite all'ingegnerizzazione di un virus
herpes simplex oncolitico re-indirizzato verso i recettori espressi
sulle cellule tumorali ed al disegno razionale di inibitori della
fusione attivi e specifici contro il virus herpes simplex. Alla
fine degli anni ‘80 il laboratorio di Gabriella Campadelli –Fiume
ha fornito la prima evidenza di come, tra le numerose glicoproteine
che si trovano sull'envelope del virus herpes simplex, gD
interagisca con i recettori cellulari che mediano l'ingresso del
virus. Nel 1998 il nostro gruppo, insieme ad altri, ha identificato
la nectina-1, una molecola di adesione intercellulare, come
recettore per gD di HSV, e ne ha caratterizzato l'ortologo murino.
gD può anche utilizzare un recettore alternativo, HVEM (Herpesvirus
Entry Mediator). Studi recenti hanno evidenziato come gD ricopra
anche la funzione di segnalare il riconoscimento del recettore a gB
innescando così la fusione. Per esercitare queste due funzioni,
l'ectodominio di gD è organizzato in due regioni differenti dal
punto di vista topologico e funzionale. La porzione amminoterminale
(amminoacidi 1-260 della proteina matura) comprende i siti di
legame ai recettori. La porzione carbossiterminale comprende il
dominio pro-fusogenico (profusion domain, PFD), necessario
per l'innesco della fusione, ma non per il legame con il recettore
cellulare. Quest'ultima attività è stata inferita dall'osservazione
che gD solubile ripristina l'infettività di un virus deleto di gD,
ammesso che sia composta non solo dalla regione che interagisce con
il recettore, ma anche dalla regione a valle, almeno fino al
residuo 285. Dati biochimici e strutturali indicano chiaramente
come le proprietà predominanti del PFD di gD siano la facoltà di
legare la porzione amminoterminale della glicoproteina non
legata e la possibilità di essere spiazzata dal proprio sito
di legame quando gD interagisce con uno dei suoi recettori. Il
modello che ne consegue evidenzia come, nella gD nativa non legata,
la regione carbossiterminale si reclini su se stessa ed
avvolga la regione amminoterminale; ciò consente a gD di adottare
una conformazione chiusa autoinibita. In seguito al legame di gD
con uno dei suoi recettori, l'interazione tra l'amminoterminale ed
il carbossiterminale viene meno, il carbossiterminale non è più
trattenuto e viene spiazzato dal proprio sito di legame
sull'amminoterminale: gD adotta una conformazione aperta. Oltre a
gD, l'ingresso di HSV richiede altre tre glicoproteine gB, gH e gL.
La chiave per delineare come gD segnali il riconoscimento del
recettore alle glicoproteine a valle è stata l'identificazione di
un complesso sopramolecolare che si forma tra le quattro
glicoproteine in seguito al legame di gD con uno dei recettori. Le
glicoproteine vengono reclutate nel complesso seguendo un ordine
specifico. gD legata al recettore recluta gB; in seguito il
complesso recettore-gD-gB recluta gH.gL. L'assemblaggio del
complesso richiede uno dei recettori di gD, sia esso nectina-1 o
HVEM.
Esecuzione della fusione: gH e gB
Una ricerca bioinformatica è stata condotta sulle quattro
glicoproteine per mezzo di un predittore basato su reti
neurali. E' emerso come gH sia la sola glicoproteina di HSV che
abbia nel proprio ectodominio una a-elica altamente
idrofobica (chiamata a-H1) e due heptad repeats (HR-1
e HR-2). Un'accurata caratterizzazione di questi elementi
strutturali ha candidato l' a-elica1 ad essere un peptide di
fusione. I due heptad repeats interagiscono tra loro
formando un coiled coil. Queste proprietà sembrano essere
essenziali per governare il massiccio riarrangiamento
strutturale che ha luogo durante la fusione. Recentemente è stata
risolta la struttura del cristallo di gB. Essa ha evidenziato come
gB sia un trimero dotato di un nucleo a coiled coil e
come, a livello strutturale, sia molto simile alla glicoproteina
dell'envelope (G) del virus della stomatite vescicolare
(VSV). Questa è un'osservazione sorprendente poiché non
vi era a priori nessun suggerimento che portasse a pensare che gB
avesse la tipica struttura di una glicoproteina fusogenica virale.
Al momento lo scenario più verosimile prevede che gH e gB formino
un complesso, e che insieme le due glicoproteine agiscano da
esecutori della fusione.
Design razionale di inibitori della fusione
L'identificazione di gH come candidato esecutore della fusione
in HSV, unitamente alla scoperta che peptidi sintetici che mimano
gli heptad repeats inibiscono l'infezione, sono state le
basi per un progetto approvato dalla Comunità Europea (operativo da
gennaio 2007), chiamato TargetHerpes. Uno degli obiettivi del
progetto consiste nell'identificazione di bersagli molecolari per
il disegno razionale di chemoterapici antierpetici. (Gabriella
Campadelli-Fiume è il Coordinatore Europeo).
I corpi multivescicolari come comparto cellulare per
l'assemblaggio del virione di Herpes Simplex per la fuoriuscita
dalla cellula
La biogenesi dei corpi multivescicolari (multivesicular
bodies, MVB) è topologicamente equivalente alla gemmazione del
virione. Perciò diversi virus sfruttano il pathway dei MVB
per dotarsi di envelope e fuoriuscire dalla cellula.
L'assemblaggio e la fuoriuscita di HSV vengono compromessi quando
vengono espresse forme dominati negative di due componenti
del pathway dei MVB Inoltre l'infezione di HSV-1 porta
a cambiamenti morfologici dei MVB. gB, una delle
glicoproteine più conservate nella famiglia degli
herpesviridae, viene indirizzata alle membrane dei MVB. gB è
ubiquitinata sia in cellule infette che trasfettate.
L'ubiquitinazione avviene tramite la lisina63
dell'ubiquitina ,che può determinare l'indirizzamento della
proteina (cargo sorting) verso i MVB. Questa linea di
ricerca suppone che l'indirizzamento di gB verso i MVB rappresenti
un passaggio critico nell'acquisizione dell'envelope di
HSV-1 e della sua fuoriuscita dalla cellula, e che membrane
modificate di MVB costituiscano una piattaforma per l'acquisizione
dell'envelope di HSV-1 nella cellula, o che, in alternativa,
componenti dei MVB siano reclutati durante questo processo.
Reindirizzamento del tropismo di HSV verso recettori
eterologhi
Le basi molecolari dell'ingresso di HSV nella cellula hanno
aperto la strada per una riuscita modificazione del tropismo
di HSV verso recettori eterologhi. Herpes virus sono stati
utilizzati come virus oncolitici, principalmente nella cura del
glioblastoma. I margini di sicurezza sono stati ampliati
debilitando la replicazione virale, facendo in modo che i virus
potessero replicarsi solo nelle cellule proliferanti del
tumore, ma non nelle cellule quiescenti neuronali. Questi virus
modificati sono stati saggiati in test clinici di fase 1 e 2 con
risultati promettenti, anche se gli effetti terapeutici sono
inficiati dai bassi livelli di replicazione. L'attuale obiettivo
consiste nella realizzazione di un HSV reindirizzato in modo
specifico verso i recettori espressi nelle linee tumorali a non
nelle cellule sane, in modo da poter utilizzare virus meno
debilitati. Roizman e Zhou hanno escogitato una strategia di
successo per modificare il tropismo del virus. Essa consiste
nell'inserzione di un ligando in gD che consenta alla glicoproteina
di rispondere al riconoscimento di un recettore e di innescare la
fusione. Negli Stati Uniti sono stati introdotti in gD due ligandi,
IL13 e l'urochinasi attivatore del plasminogeno. Negli ultimi anni,
il nostro laboratorio ha ingegnerizzato un HSV reindirizzato in
modo specifico verso il recettore HER2/neu, membro della famiglia
EGFR, overespresso nei tumori mammari e dell'ovaio. Circa il 25-30%
dei tumori mammari (quelli con la prognosi più nefasta e con
più alta metastaticità) esprimono tale recettore. Poichè HER2/neu
non possiede un ligando naturale, il ligando che abbiamo utilizzato
è stato un single chain antibody (scFv) diretto contro
HER2/neu.
Recentemente sono stati ingegnerizzati con successo HSV
completamente reindirizzati verso HER2 e de-indirizzati dai
recettori naturali di HSV, nectina1 e HVEM. Questi virus
ricombinanti evidenziano attività oncolitica in vivo, in
particolare in topi xeno-trapiantati con tumori umani positivi a
HER2
