L'attività di ricerca riguarda lo sviluppo di biosensori cellulari
luminescenti per la determinazione della biodisponibilità e
dell'attività biologica di molecole di interesse ambientale,
tossicologico e farmaceutico. Sono stati sviluppati e validati
biosensori cellulari bioluminescenti per distruttori endocrini
utilizzati in procedure di screening ad alta produttività per il
monitoraggio di tali composti in matrici complesse quali campioni
ambientali, alimentari e clinici. Sono state inoltre clonate nuove
luciferasi con diverse caratteristiche spettrali tramite mutagenesi
“random” o sito-diretta utilizzando la sequenza di luciferasi
wild-type o tramite clonazione di nuovi geni di luciferasi. Sono
stati sviluppati metodi BRET sia in vitro sia in vivo per
monitorare la dimerizzazione del recettore alfa umano per gli
estrogeni e sono in corso di sviluppo nuovi metodi BRET per
studiare l'etero-dimerizzazione di recettori
nucleari tramite uso di nuovi donatori luminescenti.
Clonaggio e caratterizzazione di nuove proteine reporter
bioluminescenti
Al fine di migliorare le prestazioni di metodi bioanalitici in
vivo e in vitro che utilizzano proteine bioluminescenti,
quali ad esempio “cell-based assays” basati sulla tecnologia dei
geni reporter e modelli bioluminescenti in vivo, sono state
ottenute nuove proteine bioluminescenti con ottimizzate proprietà
di emissione e migliore termostabilità. A differenza dei traccianti
convenzionali, questi traccianti hanno natura proteica ed
utilizzando le attuali tecniche di ingegneria genetica è quindi
possibile introdurre la sequenza che codifica per una di queste
proteine all'interno di un determinato organismo, rendendolo in
grado di produrre la proteina bioluminescente (rivelabile, dopo
aggiunta del substrato bioluminescente, mediante una misura di
luminescenza).
Questa linea di ricerca è inserita nell'ambito di una
collaborazione con il gruppo di ricerca diretto dal Prof. Bruce
Branchini, (Chemistry Department, Connecticut College, CT, USA).
Luciferasi con diverse lunghezze d'onda di emissione e maggiore
termostabilità sono state ottenute attraverso tecniche di
mutagenesi “random” o “site-directed” a partire dalla sequenza
codificante della luciferasi di Photinus pyralis. Le
proprietà fotochimiche (spettri di assorbimento ed emissione, tempi
di vita e rese quantiche di emissione…) delle proteine
bioluminescenti così prodotte sono state determinate. È stata
clonata e caratterizzata la luciferasi isolata da Luciola
italica. La sequenza è stata brevettata [PCT/US2007/003546] e,
tramite mutagenesi sito diretta, sono stati ottenuti dei mutanti
con emissione a diverse lunghezze d'onda con potenziali
applicazioni nello sviluppo di “cell-based assays” e modelli in
vivo di tipo multiplexed al fine di monitorare più eventi target
simultaneamente a livello cellulare, tissutale o di un intero
organismo [Photochem Photobiol Sci, 2008].
È stata inoltre ottenuta una libreria di mutanti della
fotoproteina equorina che ha portato all'identificazione di
equorine con aumentata emivita di emissione. I risultati sono stati
esposti in una lettura su invito nell'ambito del SBS 15th Annual
Conference & Exhibition (Lille, 2008).
Sviluppo e applicazione di biosensori cellulari
bioluminescenti
Questa linea di ricerca ha riguardato lo sviluppo e
l'ottimizzazione di biosensori cellulari bioluminescenti per la
determinazione della biodisponibilità e dell'attività biologica di
analiti di interesse ambientale, clinico, alimentare e
farmaceutico. Poiché uno dei limiti nell'utilizzo dei biosensori
cellulari è la variazione del segnale legata ad alterazioni della
vitalità cellulare indotte da effetti aspecifici della matrice o
dell'analita, tutti i biosensori sviluppati sono stati ottenuti
inserendo nelle cellule un controllo interno di vitalità
rappresentato da una seconda proteina reporter con diversa
lunghezza d'onda di emissione.
In particolare cellule batteriche e di lievito (principalmente
cellule di E. coli e S. cerevisiae) sono state
geneticamente ingegnerizzate con più geni reporter bioluminescenti
in modo da rispondere a diversi analiti quali interferenti
endocrini (ad es. estrogeni ed androgeni) e xenobiotici. Sono stati
sviluppati metodi bioanalitici di tipo High Content Screening (HCS)
al fine di ottenere il maggior numero di informazioni da una
singola misura. Ad esempio è stato sviluppato un biosensore
cellulare costituito da cellule di epatocarcinoma (HepG2)
ingegnerizzate con tre luciferasi diverse per lo studio
dell'attività biologica di acidi biliari e analoghi, allo scopo di
individuare nuove molecole in grado di ridurre i livelli di
colesterolo tramite attivazione dei suoi pathways endogeni
di degradazione [Anal Chem, 2008].
I biosensori ottenuti sono stati utilizzati per analisi di
campioni ambientali, alimentari e campioni clinici (siero e urine
umani) [Nat Protoc. 2008] nell'ambito di una collaborazione con la
Prof. Lena Ekström (Division of Clinical Pharmacology, Karolinska
Instituet (Stockholm, Sweden) [Eur J Clin Invest. 2013] .
Per semplificare la procedura di analisi ed eliminare la
necessità di crescere le cellule in terreno liquido (e quindi con
l'impiego di attrezzature, laboratori e personale specializzato),
le cellule sono state immobilizzate in una matrice polimerica, che
è stata brevettata [PCT/IB2010/050625], ed è stato messo a punto un
dispositivo portatile costituito dai biosensori cellulari
intrappolati nella matrice all'interno dei pozzetti di una
cartuccia usa-e-getta, posta a contatto con un sistema di
rivelazione CCD (charge-coupled device). La luminescenza, misurata
attraverso il sistema di rivelazione, è proporzionale alla
concentrazione biodisponibile dell'analita target [Biosens
Bioelectron 2011; Anal Bioanal Chem. 2011]. Sono inoltre stati
sviluppati biosensori portatili basati su batteri magnetotattici
geneticamente ingegnerizzati [Lab Chip. 2013].
Il dispositivo permette l'utilizzo di più linee cellulari in
modo da ottenere più informazioni contemporaneamente. Ogni linea
cellulare risponde ad un diverso analita e questo consente ad
esempio di determinare la presenza di più metalli pesanti (es.
mercurio, cadmio, piombo, arsenico, rame, zinco) e/o interferenti
endocrini nello stesso campione. Le cellule immobilizzate sono
sufficientemente stabili da poter esser mantenute a +4°C per
periodi abbastanza lunghi e l'analisi è breve, richiedendo solo 1-2
ore complessive [Biosens Bioelectron 2011, Anal Bioanal Chem
2011].
Sviluppo di nuovi modelli di imaging in vivo in
bioluminescenza
Le luciferasi con emissione a diversa lunghezza d'onda ottenute
tramite mutagenesi sono state utilizzate per sviluppare nuovi
modelli xenograft di tumore nei quali è possibile monitorare
simultaneamente due eventi target. Attraverso la risoluzione
spettrale dell'emissione bioluminescente è possibile infatti
visualizzare e quantificare separatamente due linee cellulari
tumorali iniettate simultaneamente nell'animale e quindi studiare
l'evoluzione di due tipologie di tumore differenti [Mol Imaging
Biol, 2009]. Questo esempio di applicazione potrà essere esteso a
studi successivi dove verranno monitorati simultaneamente due
eventi fisio-patologici anche molto differenti in modo da ottenere
un'informazione simultanea su aspetti diversi di un processo sotto
indagine nello stesso animale senza bisogno di doverlo
sacrificare.
Utilizzo di tecniche FFF combinate con rivelazione
bioluminescente per frazionamento cellulare
Questa linea di ricerca, svolta in collaborazione con il gruppo
di ricerca del Prof. Pierluigi Reschiglian (Dipartimento di
Chimica), ha riguardato l'utilizzo di tecniche di frazionamento in
campo flusso (FFF) per separare e rivelare in modo non invasivo e
senza marcatura batteri, lieviti e linee cellulari umane.
Nell'ambito della collaborazione sono stati separati diversi tipi
di cellule esprimenti geni reporter e al fine di ottimizzare le
prestazioni e il recupero ed è stata utilizzata la rivelazione
bioluminescente.
Una delle sfide più attuali è infatti la possibilità di separare
cellule senza doverle marcare e un'applicazione ha riguardato il
settore delle cellule staminali. La tecnica gravitational
field-flow fractionation (GrFFF) è stata utilizzata per la
selezione senza marcatura di cellule staminali ematopoietiche e
cellule progenitrici da campioni ottenuti da sangue periferico
mediante aferesi [J Chromatogr A, 2009].
