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Elisa Michelini

Professoressa associata

Dipartimento di Chimica "Giacomo Ciamician"

Settore scientifico disciplinare: CHIM/01 CHIMICA ANALITICA

Temi di ricerca

L'attività di ricerca riguarda lo sviluppo di biosensori cellulari luminescenti per la determinazione della biodisponibilità e dell'attività biologica di molecole di interesse ambientale, tossicologico e farmaceutico. Sono stati sviluppati e validati biosensori cellulari bioluminescenti per distruttori endocrini utilizzati in procedure di screening ad alta produttività per il monitoraggio di tali composti in matrici complesse quali campioni ambientali, alimentari e clinici. Sono state inoltre clonate nuove luciferasi con diverse caratteristiche spettrali tramite mutagenesi “random” o sito-diretta utilizzando la sequenza di luciferasi wild-type o tramite clonazione di nuovi geni di luciferasi. Sono stati sviluppati metodi BRET sia in vitro sia in vivo per monitorare la dimerizzazione del recettore alfa umano per gli estrogeni e sono in corso di sviluppo nuovi metodi BRET per studiare l'etero-dimerizzazione di recettori nucleari tramite uso di nuovi donatori luminescenti.

Clonaggio e caratterizzazione di nuove proteine reporter bioluminescenti

Al fine di migliorare le prestazioni di metodi bioanalitici in vivo e in vitro che utilizzano proteine bioluminescenti,  quali ad esempio “cell-based assays” basati sulla tecnologia dei geni reporter e modelli bioluminescenti in vivo, sono state ottenute nuove proteine bioluminescenti con ottimizzate proprietà di emissione e migliore termostabilità. A differenza dei traccianti convenzionali, questi traccianti hanno natura proteica ed utilizzando le attuali tecniche di ingegneria genetica è quindi possibile introdurre la sequenza che codifica per una di queste proteine all'interno di un determinato organismo, rendendolo in grado di produrre la proteina bioluminescente (rivelabile, dopo aggiunta del substrato bioluminescente, mediante una misura di luminescenza).

Questa linea di ricerca è inserita nell'ambito di una collaborazione con il gruppo di ricerca diretto dal Prof. Bruce Branchini, (Chemistry Department, Connecticut College, CT, USA). Luciferasi con diverse lunghezze d'onda di emissione e maggiore termostabilità sono state ottenute attraverso tecniche di mutagenesi “random” o “site-directed” a partire dalla sequenza codificante della luciferasi di Photinus pyralis. Le proprietà fotochimiche (spettri di assorbimento ed emissione, tempi di vita e rese quantiche di emissione…) delle proteine bioluminescenti così prodotte sono state determinate. È stata clonata e caratterizzata la luciferasi isolata da Luciola italica. La sequenza è stata brevettata [PCT/US2007/003546] e, tramite mutagenesi sito diretta, sono stati ottenuti dei mutanti con emissione a diverse lunghezze d'onda con potenziali applicazioni nello sviluppo di “cell-based assays” e modelli in vivo di tipo multiplexed al fine di monitorare più eventi target simultaneamente a livello cellulare, tissutale o di un intero organismo [Photochem Photobiol Sci, 2008].

È stata inoltre ottenuta una libreria di mutanti della fotoproteina equorina che ha portato all'identificazione di equorine con aumentata emivita di emissione. I risultati sono stati esposti in una lettura su invito nell'ambito del SBS 15th Annual Conference & Exhibition (Lille, 2008).

 

Sviluppo e applicazione di biosensori cellulari bioluminescenti

Questa linea di ricerca ha riguardato lo sviluppo e l'ottimizzazione di biosensori cellulari bioluminescenti per la determinazione della biodisponibilità e dell'attività biologica di analiti di interesse ambientale, clinico, alimentare e farmaceutico. Poiché uno dei limiti nell'utilizzo dei biosensori cellulari è la variazione del segnale legata ad alterazioni della vitalità cellulare indotte da effetti aspecifici della matrice o dell'analita, tutti i biosensori sviluppati sono stati ottenuti inserendo nelle cellule un controllo interno di vitalità rappresentato da una seconda proteina reporter con diversa lunghezza d'onda di emissione.

In particolare cellule batteriche e di lievito (principalmente cellule di E. coli e S. cerevisiae) sono state geneticamente ingegnerizzate con più geni reporter bioluminescenti in modo da rispondere a diversi analiti quali interferenti endocrini (ad es. estrogeni ed androgeni) e xenobiotici. Sono stati sviluppati metodi bioanalitici di tipo High Content Screening (HCS) al fine di ottenere il maggior numero di informazioni da una singola misura. Ad esempio è stato  sviluppato un biosensore cellulare costituito da cellule di epatocarcinoma (HepG2) ingegnerizzate con tre luciferasi diverse per lo studio dell'attività biologica di acidi biliari e analoghi, allo scopo di individuare nuove molecole in grado di ridurre i livelli di colesterolo tramite attivazione dei suoi pathways endogeni di degradazione [Anal Chem, 2008].

I biosensori ottenuti sono stati utilizzati per analisi di campioni ambientali, alimentari e campioni clinici (siero e urine umani) [Nat Protoc. 2008] nell'ambito di una collaborazione con la Prof. Lena Ekström (Division of Clinical Pharmacology, Karolinska Instituet  (Stockholm, Sweden) [Eur J Clin Invest. 2013] .

Per semplificare la procedura di analisi ed eliminare la necessità di crescere le cellule in terreno liquido (e quindi con l'impiego di attrezzature, laboratori e personale specializzato), le cellule sono state immobilizzate in una matrice polimerica, che è stata brevettata [PCT/IB2010/050625], ed è stato messo a punto un dispositivo portatile costituito dai biosensori cellulari intrappolati nella matrice all'interno dei pozzetti di una cartuccia usa-e-getta, posta a contatto con un sistema di rivelazione CCD (charge-coupled device). La luminescenza, misurata attraverso il sistema di rivelazione, è proporzionale alla concentrazione biodisponibile dell'analita target [Biosens Bioelectron 2011; Anal Bioanal Chem. 2011]. Sono inoltre stati sviluppati biosensori portatili basati su batteri magnetotattici geneticamente ingegnerizzati [Lab Chip. 2013].

Il dispositivo permette l'utilizzo di più linee cellulari in modo da ottenere più informazioni contemporaneamente. Ogni linea cellulare risponde ad un diverso analita e questo consente ad esempio di determinare la presenza di più metalli pesanti (es. mercurio, cadmio, piombo, arsenico, rame, zinco) e/o interferenti endocrini nello stesso campione. Le cellule immobilizzate sono sufficientemente stabili da poter esser mantenute a +4°C per periodi abbastanza lunghi e l'analisi è breve, richiedendo solo 1-2 ore complessive [Biosens Bioelectron 2011, Anal Bioanal Chem 2011].

 

Sviluppo di nuovi modelli di imaging in vivo in bioluminescenza

Le luciferasi con emissione a diversa lunghezza d'onda ottenute tramite mutagenesi sono state utilizzate per sviluppare nuovi modelli xenograft di tumore nei quali è possibile monitorare simultaneamente due eventi target. Attraverso la risoluzione spettrale dell'emissione bioluminescente è possibile infatti visualizzare e quantificare separatamente due linee cellulari tumorali iniettate simultaneamente nell'animale e quindi studiare l'evoluzione di due tipologie di tumore differenti [Mol Imaging Biol, 2009]. Questo esempio di applicazione potrà essere esteso a studi successivi dove verranno monitorati simultaneamente due eventi fisio-patologici anche molto differenti in modo da ottenere un'informazione simultanea su aspetti diversi di un processo sotto indagine nello stesso animale senza bisogno di doverlo sacrificare.

 

Utilizzo di tecniche FFF combinate con rivelazione bioluminescente per frazionamento cellulare

Questa linea di ricerca, svolta in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Pierluigi Reschiglian (Dipartimento di Chimica), ha riguardato l'utilizzo di tecniche di frazionamento in campo flusso (FFF) per separare e rivelare in modo non invasivo e senza marcatura batteri, lieviti e linee cellulari umane. Nell'ambito della collaborazione sono stati separati diversi tipi di cellule esprimenti geni reporter e al fine di ottimizzare le prestazioni e il recupero ed è stata utilizzata la rivelazione bioluminescente.

Una delle sfide più attuali è infatti la possibilità di separare cellule senza doverle marcare e un'applicazione ha riguardato il settore delle cellule staminali. La tecnica gravitational field-flow fractionation (GrFFF) è stata utilizzata per la selezione senza marcatura di cellule staminali ematopoietiche e cellule progenitrici da campioni ottenuti da sangue periferico mediante aferesi [J Chromatogr A, 2009].