Alessandro Spadari

La validità dell'uso del gel piastrinico (PG) per accelerare i processi di guarigione in diversi tessuti è stato documentato in medicina umana. Allo stato attuale l'impiego del PG nelle specie domestiche è segnalato ma non corredato da un valido sostegno scientifico. Non è stato chiarito infatti il ruolo dei fattori di crescita, che esso è in grado di rilasciare, nei processi riparativi/rigenerativi di ogni singolo tessuto. Più precisamente in riferimento a questi fattori di crescita si vuole cercare di chiarire in quali quantità debbano essere presenti, quali siano i tempi di emivita e in che tempi e modi avvenga la loro attivazione, se ed in qual modo sia possibile isolarne alcuni da impiegarsi preferenzialmente per la guarigione di specifici tessuti.

DESCRIZIONE DELLA RICERCA Il gel di piastrine (o Platelet Gel - PG) si è affermato negli ultimi anni in medicina umana, come mezzo capace di aumentare la velocità di rigenerazione di alcuni tessuti di origine mesodermica attraverso il rilascio di fattori di crescita. I bassi costi, la relativa semplicità del suo ottenimento e la sua comprovata efficacia ne hanno avvalorato il successo. Il PG rappresenta una preparazione derivante da un concentrato di piastrine isolate dal sangue (PRP - platelet rich plasma) di un paziente ed attivate con sostanze quali il calcio gluconato e la trombina (autologa o bovina) o la batroxobina. Durante l'attivazione vengono rilasciati fattori di crescita contenuti nei granuli, capaci di stimolare l'angiogenesi, la chemiotassi dei macrofagi e la proliferazione e la migrazione dei fibroblasti: in particolare l'effetto proangiogenetico porta secondariamente ed indirettamente alla proliferazione di altre cellule. Il suo uso autologo si è dimostrato efficace soprattutto in terapie di rigenerazione cutanea e guarigione di fratture. Negli altimi 2-3 anni sono state presentate una serie di pubblicazioni sull'argomento, prevalentemente rassegne di casistiche cliniche sull'applicazione del gel per patologie tendinee cutanee e in caso di fratture sia nel cane che nel cavallo. Presso la nostra struttura è stato adottato l'uso del PG autologo per favorire i processi di guarigione in cani e cavalli affetti da patologie di interesse ortopedico e cutaneo, anche come veicolo e/o scaffold di cellule mesenchimali per la guarigione di lesioni tendinee. Una metodica di preparazione del gel è stata standardizzata sia per cavalli che per cani oltre 25 kg, con prelievo di 350 g di sangue intero, raccolto in una sacca da trasfusione contenente 50 ml di sodio citrato. Il sangue è sottoposto ad una prima centrifugazione a 500xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Il plasma surnatante è trasferito in un sistema chiuso satellite e ricentrifugato a 3000 x g. Il PG è rappresentato dal residuo nella sacca satellite dopo eliminazione del surnatante. Con tale sistema sono state ottenute rese di circa il 10%. Nella sede di lesione viene inoculato il PRP e immediatamente dopo gluconato di calcio e batroxobina in rapporto 5:3:1. SCOPI DELLA RICERCA Nonostante l' ampia e recente letteratura, la base biologica dell'efficacia del PG non è stata completamente chiarita. La mancanza di informazioni in tal senso rende difficoltoso ottenere miglioramenti e perfezionamenti delle tecniche di raccolta, processazione e somministrazione del PG nelle specie di interesse veterinario (cane e cavallo). Lo scopo della ricerca prevede la messa a punto di modelli in vitro in cui riprodurre l'effetto biologico del PG ed in particolare per la valutazione di neoangiogenesi. Tali modelli in vitro saranno successivamente utilizzati per una maggiore comprensione dell'effetto biologico del gel piastrinico nelle specie canina ed equina e in definitiva per elaborare tecniche che consentano di incrementare l'efficienza del trattamento con PG. METODOLOGIA DELLA RICERCA E RISULTATI ATTESI La valutazione neoangiogenetica mediante modelli in vitro presenta alcune limitazioni chiaramente descritte nel corso degli ultimi anni. Pur tuttavia, rimane ineludibile la possibilità di ottenere procedure facilmente standardizzabili, riproducibili e di ridurre il numero di animali utilizzati a fini sperimentali. La fase di messa a punto di modelli in vitro prevede l'utilizzo di colture primarie sia di endoteliali aortiche sia di endoteliali microvascolari della specie suina. Le cellule saranno cimentate con PG autologo ed eterologo con o senza aggiunta di singoli fattori di crescita e con o senza aggiunta di anticorpi inibitori di specifici fattori di crescita. Sulle colture cellulari di eseguiranno i saggi di “wound healing” e saggi di migrazione con camera di Boyden. Per ciascun saggio saranno utilizzate aliquote del medesimo PG. Parallelamente, per ciascuna combinazione di campione/trattamento si quantificà nelle cellule endoteliali l'espressione relativa di molecole di importanza neoangiogenetica mediante tecnica real-time PCR. In particolare si misurerà l'espressione di VEGF, VEGFr, bFGF, PDGFr, TF, nonché l'attività gelatinolitica (metalloproteinasi 2 e 9) mediante zimografia semiquantitativa nel surnatante delle colture cellulari nonché in estratti proteici delle stesse. Infine saranno misurati mediante ELISA quantitativa, le concentrazioni dei principali fattori di crescita contenuti nel PG nella specie suina, equina e canina. L'effetto biologico definito nel modello in vitro nella specie suina contestualmente ai dati comparativi del contenuto di fattori di crescita sia nella specie sperimentale (suino) sia nelle specie di interesse (cane e cavallo) consentiranno di definire modelli statistici per estrapolare i dati in vitro a successive valutazioni da eseguire in vivo nel cane e nel cavallo.