Le ricerche correnti si focalizzano sulle seguenti
tematiche:
1) Studio delle RIP in specie di interesse agro-alimentare.
Ricerca di RIP in varie specie coltivate e non, per cercare di
comprenderne distribuzione e ruolo fisiologico.
2) Sequenziamento e clonazione di RIP di particolare
interesse.
3) Studi di correlazione struttura/funzione. Studi di struttura
mediante diffrazione ai raggi X e correlazione con la specificità
dell'azione enzimatica.
4) Studi sul meccanismo di intossicazione cellulare. Ricerche su
modalità di legame alla cellula, endocitosi, routing
intracellulare, sequenza temporale del danno ad rRNA, DNA o
eventuali altri substrati e meccanismo di morte cellulare.
5) Chemoablazione sperimentale mediante tossine. Sviluppo di una
nuova terapia per lo strabismo e per le distonie oculo-motorie,
mediante somministrazione locale nei muscoli extraoculari di RIP
libere o coniugate.
6) Coniugati carrier/tossina per la terapia sperimentale
anti-tumorale e immunosoppressiva. Realizzazione e sperimentazione
in-vitro e in-vivo di nuove immunotossine, chimiche o ricombinanti,
per la terapia di tumori ematologici, della GvHD e del rigetto dei
trapianti.
Le proteine inattivanti i ribosomi (ribosome-inactivating proteins
o RIP) appartengono strutturalmente a due classi: RIP di tipo 1, a
singola catena ad attività enzimatica, e RIP di tipo 2, a doppia
catena, una catena A ad attività enzimatica legata mediante ponte
disolfuro ad una catena B di tipo lectinico. La capacità della
catena B di legarsi a recettori sulla superficie cellulare,
favorisce l'internalizzazione della catena A, rendendo le RIP di
tipo 2 molto più tossiche delle RIP di tipo 1. E' stato dimostrato
che le RIP sono in grado di rimuovere un'adenina dall'rRNA, da cui
il nome rRNA N-glicosilasi (o rRNA N-glicoidrolasi EC 3.2.2.22). Su
questo argomento si sviluppano più linee di ricerca. 1-Studio delle
RIP in specie di interesse agro-alimentare. Le RIP sono
estremamente diffuse nel regno vegetale e la loro presenza è stata
riscontrata anche in varie piante eduli, quali zucca, barbabietola,
asparago e spinacio. Con la presente ricerca ci si propone di
estendere lo screening dell'attività RIP nelle specie vegetali non
ancora indagate, al fine di comprenderne la distribuzione.
Particolare attenzione sarà poi posta nei confronti delle specie di
interesse agro-alimentare, nelle quali i livelli di RIP nelle varie
parti della pianta saranno messi in relazione con la varietà
coltivata ed il periodo vegetativo e con situazioni di stress
ambientale quali alte o basse temperature, disidratazione e
presenza di agenti patogeni. Dalle piante in cui è presente
attività, verranno anche isolate e purificate nuove RIP, al fine di
estendere gli studi di tipo biochimico e tossicologico o,
eventualmente, per un loro impiego biotecnologico. 2- Studi di
correlazione struttura/funzione. Il ruolo delle RIP in natura è a
tutt'oggi ancora sconosciuto. Gli studi enzimologici condotti nel
nostro laboratorio hanno portato all'identificazione di nuovi
substrati per le RIP, differenti dall'rRNA, già riportato in
letteratura, quali altri RNA, acidi nucleici virali, poli A e DNA.
Gli studi enzimologici condotti sulle nuove RIP purificate e su
quelle già note saranno messi in correlazione con la presenza di
particolari domini della struttura terziaria. La struttura
tridimensionale delle RIP sarà determinata mediante
cristallizzazione e diffrazione ai raggi X. Verrà inoltre calcolato
il potenziale di superficie delle molecole, con particolare
riguardo alle cariche presenti nel sito attivo, per meglio
comprendere le differenze nell'interazione con i vari substrati.
Per studiare l'interazione RIP-ribosoma saranno inoltre introdotte
mutazioni puntiformi nel sito attivo di RIP selezionate, per
prevenire il clivaggio dell'adenina senza modificare le proprietà
di legame ai ribosomi. 3-Studi sul meccanismo di intossicazione
cellulare. Lo studio dell'interazione cellulare delle RIP è di
grande interesse, sia per la correlazione esistente tra tossicità
in vivo e citotossicità, sia per le ricadute che può avere
sull'impiego clinico di queste molecole. La presente linea di
ricerca valuterà la modalità di legame delle RIP alla membrana
cellulare, l'endocitosi e il routing intracellulare. Saranno
inoltre studiati il meccanismo di morte cellulare e la sequenza
temporale del danno all'rRNA, al DNA o ad altri substrati.
4-Chemoablazione sperimentale mediante tossine. La RIP saporina,
coniugata all'anticorpo mAb73 specifico per il recettore
dell'acetilcolina, è stata utilizzata per indurre un danno
localizzato alle cellule muscolari extraoculari. Questa
immunotossina, nel muscolo retto mediale di coniglio, ha provocato
un danno muscolare localizzato senza determinare alcuna reazione
infiammatoria e senza danneggiare i tessuti adiacenti, a differenza
del trattamento con doxorubicina. Attualmente sono in corso studi
per l'impiego di nuove RIP di tipo 2, purificate nel nostro
laboratorio, che avrebbero il vantaggio rispetto all'immunotossina
anti-AchR di colpire anche le cellule muscolari immature, impedendo
la rigenerazione. Questa ricerca di tipo traslazionale si propone
di sviluppare una nuova terapia per lo strabismo e per le distonie
oculo-motorie, patologie attualmente trattate, con scarso successo,
per via chirurgica o mediante tossina botulinica. 5-Coniugati
carrier/tossina per la terapia sperimentale anti-tumorale e
immunosoppressiva. Le immunotossine preparate con le RIP sono state
utilizzate per eliminare cellule nocive o indesiderate soprattutto
nella terapia antitumorale, nella profilassi e nella terapia del
rigetto dei trapianti e della GVHD e nelle malattie autoimmuni.
L'attuale disponibilità di anticorpi umanizzati permetterebbe la
realizzazione di nuove immunotossine dotate di maggiore stabilità e
minore immunogenicità. Tali molecole, previa sperimentazione
in-vitro e in modelli animali, potrebbero trovare applicazione
clinica principalmente nella terapia dei tumori ematologici, specie
nel caso di malattia minima residua o di neoplasie refrattarie alle
terapie convenzionali.Verranno studiate particolarmente
immunotossine antiCD22 per la terapia sperimentale dei Linfomi
Non-Hodgkin. L'anticorpo umanizzato Epratuzumab sarà coniugato a
diverse RIP di tipo 1. L'efficacia antitumorale di tali
immunotossine verrà valutata, in vitro, su colture cellulari umane
derivate da linfomi B e, in vivo, in modelli animali di topi SCID,
trapiantati con cellule linfomatose di derivazione umana.
