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Maria Carla Re

Professoressa ordinaria

Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale

Settore scientifico disciplinare: MED/07 MICROBIOLOGIA E MICROBIOLOGIA CLINICA

Temi di ricerca

Parole chiave: HIV-1 resistenza genotipica nei PBMCs Resistenza genotipica nel plasma Tropismo DNA proviral load Test di avidità osteoporosi e osteopenia comorbidità RNA viral load HTLV-1/2 resistenza genotipica (Resting cells)

Le malattie da infezione – per la periodica emergenza di nuove patologie (spesso conseguenti ad interventi umani che modificano sistemi ecologici animali in precario equilibrio), la riemergenza (anche in rapporto ai flussi migratori) di patologie che si ritenevano estinte o, comunque, contenute in ambiti geografici e/o socio-economici ristretti e la persistenza di una ampio ventaglio di situazioni morbose sempre più difficilmente controllabili per la diffusione della farmaco-resistenza nei rispettivi agenti eziologici – rappresentano, anche per i Paesi industrializzati, uno dei problemi sanitari e scientifici di maggiore impegno, come è dimostrato, tra l'altro dall'assoluto rilievo che il problema ha assunto negli ultimi rapporti annuali della OMS e dal fatto che esso è costantemente presente nell'agenda delle riunioni governative di questi ultimi anni.

In questo ambito, le ricerche del laboratorio Retrovirus* affrontano un ampio spettro di problemi di grande rilievo ed attualità nel campo della infezione da virus dell'immunodeficienza acquisita che riguardano sia  peculiari aspetti biomolecolari di base sia clinico-terapeutici.

 Il laboratorio si interessa di:

a)      Metodotiche innovative per la diagnosi di infezione

b)      Metodiche bio-molecolari per il follow-up del paziente HIV-1 sieropositivo.

c)      Determinazione delle mutazioni conferenti farmaco resistenza (a livello plasmatico e/o a livello cellulare)

d)     Caratterizzazione dei nuovi ceppi circolanti

e)      Diagnosi di infezione di HTLV-1 e 2 mediante ricerca di anticorpi specifici e mediante la ricerca del provirus

 e)   Studio dei principali meccanismi patogeni del virus dell'immunodeficienza acquisita di tipo 1 e 2



* Il laboratorio retrovirus  si avvale di una serie di strutture appositamente adibite esclusivamente ai compiti di diagnosi e di ricerca, disponendo di una serie di strumentazioni di base (cappe a flusso laminare verticale dotate di filtri assoluti, termostati a CO2, spettrofotometri, microscopi invertiti a luce normale ed ultravioletta centrifughe e ultracentrifughe, apparati per elettroforesi verticale ed orizzontale, refrigeratori ad azoto liquido, a -80 C, -20 C, etc.) e di alto livello tecnologico (sequenziatori, microscopio confocale con laser argon/cripton, strumentazione per real time PCR).

 



L'infezione da virus dell'immunodeficienza acquisita (HIV) continua ad essere l'emergenza sanitaria di maggiore rilievo a livello mondiale registrando, dall'inizio della pandemia, più di 40 milioni di persone infette

Durante il corso della infezione da immunodeficienza acquisita, l'infezione si coniuga invariabilmente alla malattia, in grado di manifestarsi dopo un periodo variabile di latenza clinica. L'infezione da HIV-1 si sviluppa a carico di cellule bersaglio rappresentate dai linfociti CD4+ e dai monociti e, ai suoi esordi, può determinare l'espressione di una sintomatologia a volte aspecifici e comune ad altre patologie. Nel prosieguo temporale dell'infezione e del parallelo declino lento ed inesorabile del livello dei linfociti T CD4+, il paziente comincia a denunciare tutta una serie di infezioni, a volte inusuali, di tipo opportunistico e di manifestazioni cliniche di specifiche patologie organiche (midollo osseo, SNC, osso etc) sino addirittura all'espressione di forme tumorali (Sarcoma di Kaposi e linfomi) che portano all'exitus del paziente stesso. L'evoluzione clinica dell'infezione da HIV-1 è negativa, in particolare, a causa della spiccata capacità del virus di mutare il proprio genoma determinando un fenomeno di quasi-specie. Pertanto mentre il virus infettante è formato da una popolazione di virioni con un genoma relativamente omogeneo, man mano che l'infezione progredisce la popolazione virale, a causa dell'alto tasso di replicazione del virus e della concomitante comparsa di continue mutazioni, diventa sempre più genomicamente disomogenea, fino a raggiungere la presenza contemporanea di migliaia di “varianti”, con più o meno consistenti modificazioni in una o più sequenze mucleotidiche, nel paziente asintomatico ed oltre 100 milioni di varianti nel paziente in fase avanzata di malattia. Uno dei parametri per verificare il successo di una terapia antivirale è rappresentato dalla riduzione e dal successivo mantenimento a livelli non rilevabili dei valori del viral load nel soggetto sottoposto a trattamento farmacologico; tuttavia, in alcuni casi si può verificare un fallimento terapeutico, caratterizzato da un rebound della viremia dovuto a moltepli fattori quali per esempio dosaggi farmacologici sub-ottimali, variazioni individuali di farmacocinetica e farmacodinamica, scarsa rapidamente il sopravvento e vanificare l'efficacia terapeutica dei farmaci. Dall'insieme di tutte queste considerazioni, nasce la necessità clinica del monitoraggio virologico “innovativo” del paziente HIV-infetto, in quanto oggi assolutamente fondamentale tenere in considerazione non solo il carico virale (HIV-1RNA viral load) ma anche il carico provirale (DNA viral load), per verificare la presenza del virus latente in determinati citotipi cellulari e la determinazione cellulare e plasmatica di mutazioni presenti a livello del genoma virale e in grado di condizionare i protocolli terapeutici. Infatti, la replicazione virale non solo non viene completamente interrotta dalla terapia, ma l'evoluzione del virus procede, determinando l'emergenza di ceppi resistenti e la divergenza evolutiva delle quasispecie virali nelle sottopopolazioni cellulari che ospitano l'infezione. Pertanto, è necessario quantificare il DNA provirale presente nelle cellule circolanti (al momento considerato un parametro da utilizzare esclusivamente a scopo di ricerca), dato che i livelli di DNA provirale si sono mostrati legati anche alla progressione della malattia, con valori crescenti man mano che progredisce il livello di deplezione dei linfociti CD4. Un ulteriore e indispensabile parametro virologico è rappresentato dal monitoraggio delle farmacoresistenze non solo a livello plasmatico che rappresenta una realtà accettata, a livello dei linfociti periferici vista la capacità del virus di latentizzarsi, sin dai primi stadi dell'infezione in alcuni distretti anatomici (reservoirs virali), dove ceppi virali mutati possano perdurare per molti anni. In base a quanto detto, scopo della ricerca sarà quello di sviluppare le tre tematiche descritte (RNA viral load, DNA proviral load; e farmacoresitenza a livello intracellulare (a livello dei CD4, cellule bersaglio dell'infezione) e a livello extracellulare (plasmatica) in modo sincrono in due gruppi di soggetti, sottoposti a terapia HIV-1 infetti, in fase acuta e in fase cronica rispettivamente al fine di verificarne il significato clinico per potere fornire al clinico indicazioni relative al ceppo virale infettante e alla ottimizzazione dei protocolli terapeutici disponibili

 

 

In particolare

a)      Metodotiche per la diagnosi di infezione

Messa a punto di un metodo in grado di distinguere l'infezione acuta dalla infezione cronica basato sul livello di avidità anticorpale. 

b)      Metodiche bio-molecolari per il follow-up del paziente sieropositivo.

Con l'introduzione dell' ”highly active antiretroviral therapy” (HAART)  si è assistito, in tutti i paesi industrializzati, ad una netta diminuzione dei casi di AIDS conclamato e ad un netto miglioramento della qualità di vita dei soggetti infettati dal virus dell'immunodeficienza acquisita. Nel 1997 numerosi lavori   generarono un discreto ottimismo, basato fondamentalmente su modelli matematici che provavano il rapido abbattimento della carica virale plasmatica in seguito a triplice terapia. Purtroppo sempre nello stesso anno tre gruppi di ricercatori dimostrarono contemporaneamente che il virus non solo era in grado di persistere nei  linfociti CD4 per un lunghissimo periodo di tempo in tutti i soggetti infetti nonostante la terapia, ma anche la capacità del  virus stesso a replicarsi attivamente, cancellando, pertanto, le speranze iniziali

Oggi a quasi 10 anni di distanza da queste prime osservazioni, i  dati della letteratura sono concordi nell'affermare che allo stato attuale il virus non può essere completamente eradicato. Infatti anche se, dopo la terapia antiretrovirale, il numero delle copie di HIV-RNA, nel sangue periferico, raggiunge dei livelli non rilevabili dai comuni saggi usati nella pratica clinica, il virus è ancora  presente  in alcuni distretti, i cosiddetti “reservoir”, quali il midollo osseo, i linfonodi e il sistema nervoso centrale. Diversi studi hanno mostrato la potenziale utilità clinica della determinazione quantitativa di HIV- DNA nei linfomonociti di sangue periferico in quanto  possibile marcatore di progressione dell'infezione di HIV   e indicatore precoce di ripresa della replicazione virale in caso di fallimento terapeutico o durante le interruzioni del trattamento 

Allo stato attuale delle conoscenze è possibile affermare che oltre ai linfociti CD4, anche i monociti e i macrofagi potrebbero giocare un ruolo importante nella latenza di HIV . In particolare, sin dai primi studi di David Ho  fu chiaro che sia  i macrofagi sia i  monociti sono in grado di produrre virus competente anche se a livelli inferiori rispetto ai linfociti .

Pertanto uno dei maggiori ostacoli alla eliminazione di HIV-1 era ed è rappresentato proprio dallo stabilirsi di una infezione latente in determinati distretti cellulari, serbatoio virtualmente inesauribile e pronto a produrre nuovo virus una volta che venga a mancare l'effetto farmacologico della terapia.

L a replicazione virale, in effetti, viene solamente rallentata dalla terapia, permettendo l'evoluzione del virus e determinando l'emergenza di ceppi resistenti, oltre che la divergenza evolutiva delle quasispecie virali nelle sottopopolazioni cellulari che ospitano l'infezione .

Oggi abbiamo a disposizione molti dati di letteratura sulla presenza del DNA provirale a livello di determinati compartimenti cellulari e anche indicazioni specifiche sul significato di questo reservoir.  Pur dovendo tenere in considerazione che la determinazione del numero di copie di HIV-1 RNA (a livello plasmatico)  rimane di fondamentale ausilio nel monitoraggio del paziente infetto, la quantificazione del numero di copie di provirus cellulare potrebbe nel futuro essere considerato uno tra i markers utilizzabili per individuare strategie terapeutiche alternative.

I dati disponibili in letteratura non portano sempre a risultati univoci, a nostro avviso, fondamentalmente  per la mancanza di standardizzazione della metodica utilizzate sia per quello che riguarda la determinazione del DNA integrato e del DNA totale, oltre, naturalmente la tipologia dei pazienti arruolati nei vari studi. A causa della peculiare strategia replicativa di HIV, durante le prime fasi dell'infezione cellulare, l'RNA virale viene trascritto in DNA lineare a doppio filamento e in seguito integrato a livello del cromosoma cellulare. In assenza di integrazione, il DNA extracromosomale potrà presentarsi in forma lineare o in forma circolarizzata con 1 o 2 LTR . Anche a tale proposito e cioè se lo studio del carico provirale debba essere effettuato sul DNA integrato o meno, un'analisi dettagliata dei dati di letteratura mette in evidenza la mancanza di un “consensus” su quale sia il metodo di elezione per la determinazione quantitativa dei livelli di HIV DNA; i metodi in uso sono, infatti, molteplici e non sempre risulta possibile il confronto dei risultati ottenuti in diversi laboratori. In particolare le metodiche riportate in letteratura, basate sul principio della PCR convenzionale, comprendono saggi di PCR: classica, semiquantitativa,quantitativa, quantitativa basata sul metodo di Real Time PCR o di modifiche di saggi commerciali originariamente dedicati alla determinazione dell'HIV-RNA  e di PCR chiamate “Mega-PCR” associate all'utilizzo di particolari biglie di cattura del DNA  .

Oggi abbiamo a disposizione numerose indicazioni sul significato del DNA totale, i cui livelli sembrano essere direttamente correlati alla progressione della malattia  e nella maggior parte dei casi inversamente correlati ai linfociti CD4. Inoltre, le implicazioni cliniche della persistenza per lunghissimi periodi di tempo del DNA provirale a livello dei linfociti CD4 sono al centro di uno stimolante dibattito scientifico: Goujard et al hanno dimostrato che i livelli di HIV DNA sono in realtà predittivi del rischio di progressione, indipendentemente dai livelli di CD4 e di RNA plasmatici. Recentemente, la presenza di alti livelli di  HIV DNA durante l'infezione acuta sembrano essere predittivi dell'andamento  della progressione futura dell'infezione e un'altra serie di studi effettuati su soggetti aviremici suggerisce che la valutazione del carico provirale potrebbe fornire indicazioni fondamentali nel caso di interruzioni programmate di terapia  , dal momento che: i) l'innalzamento della carica provirale dopo sospensione della terapia sembra essere un evento transitorio, seguito da un sensibile abbattimento alla ripresa della terapia; ii) in alcuni pazienti, un mancato innalzamento del DNA provirale potrebbe essere associato  alla capacità del paziente di continuare a controllare la replicazione virale anche in assenza di terapia.

Inoltre la presenza di un livello consistente di DNA provirale anche nei soggetti aviremici (HIV-1RNA <50 copie per ml) testimonia ancora una volta come la determinazione quantitativa della carica provirale possa rappresentare un marker significativo sia per esplorare i reservoir virali sia per avere indicazione relative all'impatto a lungo termine della terapia antiretrovrale.

Molto meno numerose e stringenti sono le evidenze sul significato potenziale del DNA provirale non integrato, la cui determinazione viene effettuata con metodi molecolari focalizzati sulla rivelazione delle forme circolari con due LTR. La distinzione tra DNA provirale integrato ed episomale è sicuramente di grande rilevanza: sembra certo che le forme di DNA non integrato possano essere transitorie ed essere correlate ad una infezione de novo delle cellule TCD4+. Livelli elevati di DNA sembrano essere presenti in soggetti con elevati livelli di virus circolante e viene con una attiva replicazione plasmatici del virus e viene suggerito la quantificazione del DNA circolare non integrato (2LTR-DNA) come marker di progressione  Alcuni dati  indicano, altresì, che all'interruzione della terapia segue un rapido innalzamento delle forme non integrate, principalmente associate a nuovi eventi di infezioni di cellule circolanti.

Negli ultimi quindici anni, l'utilizzo di tecniche basate sulla PCR ha permesso di indagare aspetti fondamentali relativi ai temi di persistenza del DNA provirale e alla cinetica della integrazione, permettendo di ottenere informazioni utilizzabili per lo sviluppo e la messa a punto di nuove molecole farmacologiche in grado di penetrare all'interno del nucleo cellulare e/o di attaccare i reservoir inducendo l'espressione di provirus quiescenti

Nonostante gli innumerevoli sforzi effettuati dalla comunità scientifica, esistono ancora dei margini di dubbio sul significato di questo marker. Noi riteniamo che sia necessario un miglioramento e una standardizzazione delle tecniche utilizzate (almeno nelle due forme più significative, totale e non integrato), che ancora oggi sono in house o modificazioni di metodi commerciali. Dato che siamo fortemente convinti che non è possibile trarre informazioni determinanti per la gestione clinica dei pazienti con metodologie non ancora standardizzate e con un favorevole rapporto costo/beneficio, abbiamo creato un gruppo di lavoro che, in base alle esperienze dei singoli operatori, possa fornire indicazioni sia sulla metodologia sia sulla applicabilità del metodo. Il gruppo di studio coordinato dal laboratorio retrovirus di bologna ha visto il coinvolgimento di diversi centri di ricerca, con cui ha lavorato in modo paritetico e strettamente collaborativo, mettendo a disposizione i dati ottenuti, al fine di ottenere informazioni riproducibili con un test standardizzato su un numero ampio di pazienti  

Pertanto gli obiettivi fondamentali, che il gruppo di ricerca si è posto, possono essere così schematizzati:

Standardizzazione della metodica per la quantificazione di DNA provirale nei soggetti HIV-1 infetti;

Stesura del protocollo;

Applicazione del protocollo su alcune tipologie di pazienti;

Caratterizzazione molecolare dei ceppi isolati.

Relativamente a quest'ultimo obiettivo, il progressivo cambiamento del quadro epidemiologico negli ultimi anni, caratterizzato da un significativo aumento della trasmissione di HIV-1 mediante rapporti eterosessuali, e da un crescente numero di infezioni  riscontrate in soggetti immigrati da Paesi in via di sviluppo, dove i sottotipi non-B e le forme ricombinanti di HIV-1 sono prevalenti, suggeriscono fortemente una possibile comparsa in Italia di una nuova ondata epidemica sostenuta da tali forme genetiche virali  

 

c)      Determinazione delle mutazioni conferenti farmaco resistenza (a livello plasmatico e/o a livello cellulare) L'introduzione della terapia con più farmaci antivirali ha cambiato la storia naturale dell'infezione da HIV, portando a un calo significativo del numero di pazienti che necessitano di ricovero ospedaliero e a una drastica riduzione della mortalità. Anche se la significativa riduzione della viremia plasmatica, associata all'arresto del depauperamento del sistema immunitario generò, alla fine degli anni '90, un cauto ottimismo su una possibile eradicazione della infezione, studi successivi hanno dimostrato che la replicazione virale non solo non viene completamente interrotta dalla terapia ma che l'evoluzione del virus procede, determinando l'emergenza di ceppi resistenti e la divergenza evolutiva delle quasispecie virali in diverse sottopopolazioni cellulari. Pertanto è nata l'assoluta necessità di studiare la presenza del virus “archiviato” a livello intracellulare e la presenza di mutazioni virali (intra e extra cellulari) in grado di suggerire un corretto percorso terapeutico.

 

d)         Determinazione del tropismo virale di HIV. La recente introduzione di nuove molecole farmacologiche in grado di bloccare l'entrata del virus nella cellula target ha reso indispensabile lo studio del tropismo virale.  In particolare l' introduzione di una molecola che ha un meccanismo d'azione completamente diverso da quello dei farmaci attualmente in uso nella ART apre a nuove possibilità di trattamento e rappresenta una speranza concreta di vincere la battaglia contro l'HIV. A tale proposito  gli inibitori del corecettore  CCR5 aprono nuove strade per la terapia del soggetto HIV infetto, mala loro somministrazione prevede, prima della somministrazione del farmaco e a tempi successivi l'esecuzione di un test specifico,  in grado di identificare il ceppo di HIV presente in quel determinato paziente. La variante R5-tropica è comune negli stadi precoci dell'infezione mentre, con il passare del tempo, l'X4-tropico diviene gradualmente dominante. Maraviroc d'altra parte è stato approvato, in combinazione con altri farmaci antiretrovirali per la terapia di pazienti adulti che sono stati già trattati con altri farmaci anti-HIV e che presentano un'alta carica virale Pertanto il laboratorio retrovirus è in grado di eseguire i test genotipici per la caratterizzazione del virus infettante, e quindi di distinguere pazienti ineftti con virus R5 tropico, X4 tropico o dual mixed.

 

  e)      Studio dei principali meccanismi patogeni del virus dell'immunodeficienza acquisita di tipo 1 e 2. Osteoporori e osteopenia:. HIV presenta una patogenesi estremamente complessa, essendo in grado di innescare nell'ospite una serie di meccanismi non ancora chiaramente definiti. Il virus, infatti si replica attivamente  nelle cellule linfocitarie T CD4+ e nei monociti/macrofagi e determina consistenti danni a tessuti come il sistema nervoso centrale, le cellule ematopoietiche, il tessuto osseo, il sistema cardiovascolare  e il rene. In particolare, i pazienti che albergano l'infezione possono presentare - in un numero consistente di casi - un progressivo danno della struttura ossea con osteopenia/osteoporosi a rapida evoluzione con la comparsa di fratture ossee. La comparsa di lesioni ossee sono state messe in relazione anche al trattamento antiretrovirale (HAART) aggiungendo un ulteriore livello di complessità per la gestione del paziente e della sua terapia. E' in corso un progetto di ricerca per verificare se il virus dell'immunodeficienza acquisita di tipo 1 (HIV-1) o sue proteine specifiche siano   in grado di esprimere una azione diretta sulle cellule osteoblastiche e di  analizzare in modo approfondito il rapporto virus/cellula e i meccanismi patogenetici innescati dal virus nel compartimento osseo. A tale proposito si è anche tenuto in considerazione che la terapia farmacologica possa concorrere o addirittura incrementare il danno osseo, e a tale proposito, durante la prima fase sperimentale abbiamo studiato l'azione biologica di HIV-1 e di specifiche proteine virali su linee cellulari osteoblastiche/osteoclastiche e cellule primarie per analizzare gli effetti virali sulla proliferazione/sopravvivenza cellulare attraverso studi molecolari dell'espressione genica e proteica di fattori specifici.

       I risultati ottenuti al momento hanno dimostrato:

·         Una diretta correlazione tra riduzione della densità ossea e infezione da HIV nei pazienti HIV sieropositivi non ancora trattati farmacologicamente, fenomeno che ha permesso di individuare l'infezione di HIV come causa della comparsa di osteopenia/osteoporosi in tali pazienti.

·         Un aumento alcune citochine, come RANKL, OPG e TRAIL,  le quali con differenti modalità intervengono nella regolazione della struttura ossea. In particolare la dimostrazione di una regolazione positiva (a livello plasmatico) di RANKL con una alterazione del rapporto OPG/RANKL plasmatico degli stessi pazienti sembra essere strettamente correlata alla diminuzione della massa ossea studiata con Densitometria ossea (DXA) in grado di certificare il grado di mineralizzazione delle ossa stesse e, pertanto, di rappresentare l'esame di riferimento per la diagnosi di osteoporosi. I dati ottenuti mettono, pertanto, in evidenza un ruolo patogenetico nel danno osseo di tali proteine, notoriamente coinvolte nella omeostasi del tessuto osseo e nella dinamica fisiologica di interazione tra osteoblasta/osteoclasto.

·         La morte cellulare programmata delle cellule osteoblastiche primarie e di linee cellulari di natura osteoblastica dovuta al trattamento con HIV e/o con proteine virali specifiche (HIV-gp120). Di particolare rilievo il dato che l'induzione alla apoptosi o morte cellulare non sembra essere assolutamente correlata alla infezione (produttiva e/o latente) degli osteoblasti, dato convalidato dalla dimostrazione -mediante metodi molecolari (dimostrabile sia mediante un aumento dell'RNA messaggero specifico, sia mediante l'aumento della proteina stessa) in seguito alla interazione gp120/osteoblasti - che tali cellule risultano essere  resistenti all'infezione, ma oltremodo sensibili alla interazione del virus con recettori di membrana cellulare. Tale interazione (virus/recettori di membrana) è risultata essere in grado, a sua volta, di determinare la sintesi di un fattore (TNF-alfa) capace di indurre l' apoptosi osteoblastica, mediante un circuito di tipo autocrino-paracrino

·         La capacità di Tat (trans-activating protein), una delle proteine di HIV più importanti nella biologia dell'infezione da HIV ed essenziale al ciclo replicativo, di indurre la differenziazione e l'attivazione funzionale degli osteoclasti inducendo un aumento della loro attività litica a carico della struttura ossea.

·         L'induzione della sintesi di RANKL e quindi di una potenziale induzione dell'attività osteoclastica da parte di alcuni farmaci anti-retrovirali saggiati singolarmente in vitro su linee osteoblastiche.

·         Queste osservazioni possono avere una importante ricaduta sulla terapia antiretrovirale, in quanto alcuni studi hanno descritto come la terapia antiretrovirale, eseguita mediante specifici protocolli, possa accellerare -mediante meccanismi ignoti - la riduzione della densità ossea.

 

 

 

 

 

e)      Diagnosi di infezione di HTLV-1 e 2 mediante ricerca di anticorpi specifici e mediante la ricerca del provirus. Vengono periodicamente eseguiti controlli per la presenza di anticorpi anti HTLV-1 e 2 nella popolazione sana” e in gruppi di popolazione con problematiche ematologiche. E' stato inoltre messo a punto una reazione di polimerazzione a catena in grado di evidenziare la presenza del provirus sia a livello qualitativo, sia a livello quaantitativo

 

 

 

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