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Maria Carla Re

Professoressa ordinaria

Dipartimento di Medicina Specialistica, Diagnostica e Sperimentale

Settore scientifico disciplinare: MED/07 MICROBIOLOGIA E MICROBIOLOGIA CLINICA

Collaborazioni

Collaborazione formale con:
Università di Roma
Paese:
Italia
Descrizione:
I fattori di restrizione. significato e ruolo durante il corso di infezione da HIV. Progetto finanziato PRIN. Collaborazione con Università la Sapienza Roma Questo progetto fa parte di un PRIN (Progetto di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale) ed ha come protagonista principale il virus dell’ HIV-1, in quanto virus capace di instaurare nell’ospite infezioni latenti e persistenti. In particolare questo progetto si focalizza sulle interazioni ospite/virus che caratterizzano l’infezione e a tal proposito si concentra sul ruolo di proteine cellulari, i RFs, le quali svolgono un ruolo importante durante il ciclo replicativo del virus, influenzando probabilmente l’istaurarsi dello stato di latenza e persistenza virale. Per questo progetto verrà inizialmente selezionato un gruppo di RFs (APOBEC3G, Theterin (BST2), TRIM5α, TRIMCyp, MX2 e SAMHD1) dei quali è nota la loro capacità di interferire con alcuni step del ciclo replicativo del virus, in particolare con il meccanismo della retrotrascrizione virale di cui ne causano un blocco in seguito ad alterazioni strutturali del complesso di retrotrascrizione virale (RTC). Alcuni di questi fattori possono bloccare anche l’ingresso del Provirus nel nucleo della cellula infettata, oppure prevenire il rilascio di nuove particelle virali, prevenendo cosi un allargamento dell’infezione a cellule adiacenti. Lo scopo principale di questo progetto è quello di ottenere un metodo sperimentale standard con cui poter analizzare e meglio caratterizzare i determinanti legati all’ospite e che intervengono durante l’infezione da HIV-1, fornendo informazioni utili per l’identificazione di nuove strategie terapeutiche più mirate, in grado di debellare completamente il virus dal suo reservoir cellulare. Accanto alle strategie terapeutiche un altro obiettivo sarà quello di riuscire a controllare e ridurre lo stato di infiammazione cronica che è associata all’infezione da HIV-1. In particolare ci focalizzeremo sui seguenti tre punti: - Caratterizzazione del ruolo dei RFs durante lo stato di latenza virale e analizzare la possibile correlazione tra l’attivazione del virus e l’induzione di uno stato di infiammazione cronica con associata produzione virale. - Analisi della variazione dell’espressione genica dei RFs durante l’infezione parallelamente a quella delle principali proteine accessorie del virus (Vif, Vpu, Vpx, Nef e Vpr) quali strumento con cui il virus riesce ad antagonizzare l’attività dei RFs. - Analisi dell’espressione di citochine e chemochine durante la risposta infiammatoria contro l’infezione da HIV e il loro ruolo nell’attivazione di una risposta immune e infiammazione cronica. A tale scopo verranno allestiti degli esperimenti in vitro utilizzando linee cellulari continue, come quelle delle C8166, o linee cellulari primarie, quali PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) derivate dal sangue periferico di soggetti donatori sani. Studi ex vivo saranno inoltre allestiti partendo da PBMCs ottenuti da pazienti HIV-1 positivi e sotto trattamento terapeutico, con una viremia residua o non rilevabile. L’impatto di questo studio nel campo della ricerca sull’ HIV può essere notevole in quanto permetterebbe una maggiore comprensione di quei meccanismi virali, ma anche cellulari, che governano l’infezione e la patogenicità di questo virus. La caratterizzazione di proteine cellulari coinvolte in tali meccanismi potrebbe allo stesso tempo suggerire nuovi target molecolari per l’ideazione e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la cura dell’HIV. Quello che ci aspettiamo di ottenere è: - I livelli di espressione dei RFs durante l’infezione, nei diversi sistemi cellulari che abbiamo intenzione di utilizzare, possa differire nei diversi stadi del ciclo replicativo del virus. Durante l’infezione le cellule potrebbero esprimere maggiormente questi fattori dimostrando quindi il loro ruolo con attività antivirale. - L’analisi dell’espressione genica e proteica potrebbe favorire l’identificazione di nuovi elementi appartenenti all’immunità innata e che giocano un ruolo nell’induzione di risposte infiammatorie. Articolazione del progetto Il progetto si articola su tre anni. - Primo anno: verranno eseguiti degli studi in vitro sulle linee cellulari delle C8166 e su PBMCS che verranno isolati mediante l’utilizzo di Ficoll-Paque Plus (Ficoll-Histopaque, Pharmacia, Uppsala, Sweden) dal sangue periferico di soggetti donatori sani anonimi,. Una volta isolati, i PBMCs verranno attivati mediante 5 mg/ml di fitoemoagglutinina A (PHA) (Sigma, St Louis, MO, USA) e 10 U/ml di interleuchian-2 (IL-2) (Pierce, Rockford, IL, USA). Il terreno di coltura arricchito con il 10% di siero bovino fetale (FBS) verrà sostituito ogni tre giorni con del terreno fresco a cui si aggiunge l’IL-2. I PBMCs verranno mantenuti in coltura ad una densità di 1x106 cells/ml. Le cellulle verranno a questo punto infettate con ceppi di HIV (HIV-IIIB and HIV ADA ), compresi quelli che sono stati isolati da pazienti infetti, con lo scopo di andare ad eseguire: o quantificazone del DNA virale o analisi dell’espressione genica o analisi dell’espressione proteica Il giorno prima dell’infezione, le C8166 e i PBMCs verranno passati per essere ad uno stadio di crescita esponenziale che favorisce l’infezione da parte del virus. Per l’infezione le cellule verranno raccolte, centrifugate e risospese ad una densità di 106 cells/mL in una soluzione contenente 1-5 ng/mL di virus. Le cellule verranno quindi incubate a 37°C per 2 ore. Dopo l’infezione le C8166 e PBMCs verranno lavate e seminate rispettivamente alle densità di 5x105 cells/ml and 1x106 cell/ml. Verrà effettuata una misurazione dei livelli della proteina vitrale p24 nel surnatante delle cellule infettate utilizzando il kit HIV-1 gag p24 antigen ELISA (Biomerieux, Marcy L9Etoile, France) il quale permette di verificare il livello di infezione. Infine, le cellule e i diversi surnatanti verranno raccolti separatamente a tre diversi time-point: 2 ore post-infezione (T0) e dopo 4-7 giorni dall’infezione (T4 e T7). Il DNA virale verrà quantificato mediante utilizzo di qRT-PCR con coppie di primer appropriate e sulla base di protocolli sperimentali in uso nel nostro laboratorio. L’analisi della variazione dei livelli di espressione genica dei RFs verrà eseguita mediante PCR Array utilizzando il RotorGene 6000 system (Corbett Reaserch) e SYBRGreen come sistema di identificazione dei prodotti di amplificazione. A tale scopo l’RNA totale verrà estratto dalle cellule mediante l’ utilizzo di miRNeasy mini kit (Qiagen) che verrà poi retro trascritto in cDNA medinate il kit RT2 first strand (Qiagen). Per la reazione di PCR verrà utilizzata la RT2 SYBR Green ROX FAST mastermix (Qiagen). Parallelamente all’espressione genica, verranno analizzati anche i livelli di espressione proteica mediante il sistema della citometria a flusso e di anticorpi specifici per i RFs. Campioni cellulari che verranno raccolti ad ogni time point, saranno lavati in PBS e fissati con Paraformaldeide 0.5%. dopo un lavaggio in PBS le cellule saranno permeabilizzate per 45 minuti mediante utilizzo di saponina 0.2% . Dopo l’incubazione, le cellule verranno nuovamente lavate e quindi marcate con anticorpo primario e successivamente con anticorpo secondario, entrambi per 30 minuti a 4°C. L’espressione dei fattori di restrizione verrà infine rilevata mediante citometria e l’intensità della fluorescenza verrà acquisita mediante FACScalibur flow cytometer (Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) mentre i dati saranno analizzati con il software CellQuest (Becton-Dickinson). - Secondo anno: gli stessi esperimenti allestiti in vitro, verranno poi translati in un sistema ex vivo. In particolare verranno raccolti il plasma e i PBMCs derivati da pazienti, dopo aver firmato il consenso informato per il trattamento dei dati sensibili. I pazienti che verranno arruolati sono pazienti naïve, ovvero pazienti che vengono infettati per la prima volta e con livelli di viremia plasmatica molto elevata, e pazienti che sono sotto trattamento terapeutico e che grazie alla cART hanno una viremia plasmatica a livelli non registrabili. Tutti i pazienti arruolati verranno ulteriormente divisi in base alla tipologia della terapia antiretrovirale seguita. Terzo anno. I dati ottenuti dagli studi in vitro ed ex vivo verranno analizzati e sperimentalmente ripetuti per confermare i risultati ottenuti.
Collaborazione formale con:
Libera Università "Vita Salute S.Raffaele" MILANO
Paese:
Italia
Descrizione:
E’ in atto una collaborazione formale con la Sezione di Virologia dell’Università San Raffaele (Milano) per la standardizzazione delle metodiche (Creazione di una rete di laboratori per la standardizzazione della determinazione quantitativa di HIV DNA nel paziente HIV infetto e per la valutazione del significato clinico e terapeutico (IIS CNAIDS –000207)

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