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Luigi Bolondi

Professore Alma Mater

Alma Mater Studiorum - Università di Bologna

Professore a contratto a titolo gratuito

Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche

Temi di ricerca

Parole chiave: microRNA terapia dell'HCC epatocarcinoma ultrasonologia cirrosi epatica celiachia

1) Caratterizzazione molecolare dell'epatocarcinoma (HCC) a fini prognostici e terapeutici. Tale obbiettivo viene perseguito mediante analisi “genome-wide” del trascrittoma e del microRNAoma in HCC con diverse caratteristiche cliniche e studio dei geni Notch nell'epatocarcinogenesi. 2) Ottimizzazione dell'utilizzo di nuove tecnologie di immagine (ecografia, RM, PET) per la diagnosi precoce ed il trattamento dell'HCC. Tali obbiettivi vengono perseguiti paragonando tecnologie innovative ancora sperimentali, affiancate alle tradizionali tecniche di immagine. 3) Sperimentazione di nuovi trattamenti nell'HCC intermedio e avanzato non passibile di trattamenti tradizionali. Le terapie attualmente in sperimentazione sono l'Irinotecan, le microsfere di Ittrio 90 radioattivo e gli inibitori dell'angiogenesi e delle MAPK. 4) Ricerca di marcatori sierici di rischio e di aggressività biologica dell'HCC. Questo studio viene effettuato mediante analisi MALDI-TOF del proteoma sierico di pazienti con cirrosi e HCC di diverso stadio e mediante l'analisi dei micro-RNA circolanti. 5) Valutazione della risposta terapeutica ai nuovi farmaci antiangiogenetici mediante tecniche di elastosonografia, mediante modelli sperimentali animali. 6) Nuove possibilità diagnostiche e terapeutiche nel campo della malattia celiaca. 7) Studio dei rapporti fegato-intestino nello sviluppo delle epatopatie e delle complicanze della cirrosi epatica.

1) Caratterizzazione molecolare dell'epatocarcinoma (HCC) a fini prognostici e terapeutici. Le linee di ricerca in questo ambito comprendono lo studio dell'espressione genica e dell'espressione dei microRNA nell'HCC e lo studio dell'espressione in casistiche “ex-vivo” e della modulazione “in vitro” dei recettori Notch nell'HCC. L'identificazione di profili di espressione genica volti alla classificazione molecolare di HCC a diversa aggressività e prognosi, in termini di focalità della malattia alla presentazione e recidiva precoce dopo resezione chirurgica, è stato effettuato mediante analisi genome-wide con microarray ed è stato validato mediante real-time PCR su una casistica prospettica in cui sono state studiate alcuni microRNA risultati abnormemente espressi nei pazienti con diverso andamento della patologia neoplastica. Lo studio dell'espressione dei microRNA (miR) nell'HCC ha evidenziato la espressione aberrante di un ristretto numero di miR. Poichè i microRNA non codificano per proteine, ma svolgono la loro funzione attraverso la modulazione dell'espressione di RNA messaggeri, abbiamo proseguito lo studio attraverso la ricerca dei possibili messaggeri target dei miR deregolati nell'HCC. Tali esperimenti, condotti su linee cellulari, utilizzano il test della luciferasi e la transfezione con miR sintetici e con anti-miR, sono volti all'identificazione dei meccanismi aberranti di modulazione dell'espressione di proteine implicate nella trasformazione neoplastica. Al momento abbiamo identificato il gene della ciclina G1 fra i target del miR-122a e stiamo concludendo la validazione di due target del miR-221. Sempre nell'ambito di ricerca dei meccanismi molecolari di epatocarcinogenesi, è corso un progetto finalizzato allo studio dell'espressione e del ruolo dei recettori Notch nell'HCC e nel colangiocarcinoma e allo studio del ruolo che tali recettori giocano nella farmaco-resistenza caratteristica di tali neoplasie. Quest'ultimo viene sviluppato su linee cellulari derivate da epatocarcinomi umani in cui viene silenziata l'espressione genica dei recettori Notch1 e Notch3 mediante tecniche di RNA-interference. Successivamente tali linee vengono sottoposte a trattamento con epirubicina. Dai dati ottenuti sino ad ora emerge un ruolo importante del Notch3 nella modulazione della resistenza al trattamento con doxorubicina in linee cellulari derivate da HCC. Le ricerche attualmente in corso sono volte all'identicazione dei meccanismi molecolari alla base di questo fenomeno. 2) Ottimizzazione dell'utilizzo di nuove tecnologie di immagine per la diagnosi precoce ed il trattamento dell'epatocarcinoma. La diagnostica differenziale delle piccole lesioni focali epatiche (1-3 cm di diametro) insorte su cirrosi può tuttora rappresentare un problema diagnostico di non facile soluzione, con conseguenze sul piano terapeutico e prognostico. In particolare è stato studiato il ruolo dell'angioecografia perfusionale nella caratterizzazione di tali lesioni che presentano tipicamente una ipervascolarizazzione in fase arteriosa con wash-out in fase portale e tardiva. E' stato individuato un sottogruppo di piccoli epatocarcinomi (HCC) che presenta una ipovascolarizzazione allo studio angioecografico ed è stato definito l'apporto di altre tecniche di immagine (TAC trifasica e RMN con mezzo di contrasto epatospecifico) nella caratterizzazione diagnostica di tali lesioni. E' stata inoltre valutata una tecnica di immagine capace di valutare simultaneamente l'aspetto TAC e l'aspetto ecografico di piccole lesioni epatiche di difficile caratterizzazione. 3) Sperimentazione di nuovi trattamenti nell'epatocarcinoma avanzato non passibile di trattamenti tradizionali. Sono in fase di completamento protocolli sperimentali sull'impiego dell'Irinotecan, delle microsfere di Ittrio radioattivo e degli inibitori dell'angiogenesi e della via delle MAPK nel trattamento dell'HCC avanzato non passibile di terapie di provata efficacia. 4) Ricerca di marcatori sierici di rischio di HCC e di aggressività biologica dell'HCC. Questo studio viene effettuato mediante analisi MALDI-TOF del proteoma sierico di pazienti con cirrosi epatica e con HCC in diverso stadio. Non sono attualmente disponibili marcatori sierici in grado di predire l'evoluzione dell'HCC in termini di sviluppo di infiltrazione vascolare e di diffusione della malattia a livello intra ed extra epatico. Lo studio proteomico attualmente in corso è volto pertanto ad individuare biomarcatori associati alla diversa evoluzione dell'HCC e si articola in due fasi: 1) studio del proteoma sierico di pazienti con HCC di piccole dimensioni (<3 cm) e senza invasione vascolare, paragonato a pazienti con HCC con invasione vascolare e diffusione intraepatica. 2) validazione dei dati accumulati nello studio esplorativo, su una casistica prospettica di pazienti con HCC seguiti longitudinalmente, al fine di identificare spettri proteomici capaci di predire l'evoluzione dell'HCC alla diagnosi.

Terapia dell’HCC

Elastografia nella valutazione precoce della risposta alla terapia farmacologica dell’epatocarcinoma

L’unica opzione terapeutica per i pazienti con epatocarcinoma che non possano essere sottoposti a terapia curative, endovascolari e radioterapiche è rappresentata dalla terapia farmacologica. Tuttavia, tali farmaci sono gravati da effetti avversi e da un elevato costo per il Sistema Sanitario Nazionale. La valutazione dell’efficacia della terapia si effettua a 2 mesi dall’inizio, utilizzando la tomografia computerizzata (CT) e la risonanza magnetica (MRI). In base alla risposta, si conferma o meno l’indicazione a proseguire con il trattamento.

Disporre di una metodica semplice ed economica, come l’elastosonografia, nella differenziazione precoce dei pazienti che trarranno beneficio da una specifica terapia potrebbe migliorare la gestione del malato. Variazioni del protocollo terapeutico potrebbero così essere condotte il prima possibile e soprattutto quando il soggetto si trova in una fase ancora utile a ricevere altri farmaci. Tale metodica si è dimostrata utile nel differenziare i tumori che stavano rispondendo o meno alla terapia farmacologica in un modello preclinico di epatocarcinoma.

L’obiettivo primario dello studio è valutare le modificazioni dell’elasticità tumorale a due settimane dall’inizio della terapia. Gli obiettivi secondari sono 1) comparare le modificazioni dell’elasticità tumorale a due settimane dall’inizio della terapia tra i pazienti con progressione di malattia (PD) ed i pazienti con stabilità di malattia (SD), risposta parziale (PR) o completa (CR) valutata con CT o MRI a 2 mesi dall’inizio della terapia; 2) correlare i dati di sopravvivenza con le modificazioni dell’elasticità tumorale a due settimane dall’inizio della terapia.

I risultati preliminari sui primi 7 pazienti hanno mostrato un irrigidimento relativo delle masse tumorali nei pazienti con SD o PR (4 pazienti, delta percentuale di elasticità -30%; -52-0) rispetto ai pazienti con PD in cui è stato riscontrato un aumento dell’elasticità (3 pazienti, delta percentuale di elasticità +35%, 35-54). Pertanto, benchè preliminari, tali dati suggeriscono una utilità dell’elastografia nella valutazione della risposta precoce alla terapia con antiangiogenetici.

Arruolamento ancora in corso. Abstract con risultati parziali presentato alla Special Conference AISF “HCC Italy 2016”, Roma, 9-10 giugno 2016.

Sorafenib versus regorafenib e ruolo dell’elastografia e dell’ecografia con mezzo di contrasto molecolare nella personalizzazione del regime terapeutico in un modello murino di epatocarcinoma

Finanziamento: Programma Regione-Università

Responsabile del Programma: Prof Luigi Bolondi

Responsabile del sottoprogetto: Dr.ssa Rita Golfieri. Collaboratori: Prof. F. Piscaglia, Dr.ssa V. Salvatore, Dr.ssa M. Milazzo

Lo scopo dello studio è confrontare l’unico farmaco attualmente approvato per l’epatocarcinoma avanzato (sorafenib) con il regorafenib, un promettente farmaco antiangiogenetico attualmente approvato come terapia di seconda linea nei pazienti in progressione con sorafenib. Inoltre, si mira a confermare l’utilità dell’elastografia nell’identificazione precoce dei pazienti non responsivi alla terapia, al fine di personalizzare il regime terapeutico.

Gli animali sono stati randomizzati in 4 gruppi, 3 dei quali hanno ricevuto sorafenib, regorafenib o placebo in monoterapia per 14 giorni. Il quarto gruppo ha ricevuto sorafenib per 2 giorni, momento in cui gli animali sono stati suddivisi in due ulteriori sottogruppi in base alle modificazioni dell’elasticità tumorale, parametro che il nostro gruppo ha identificato come predittivo di risposta alla terapia. Pertanto, in caso di aumentata elasticità, è stata continuata la terapia con sorafenib fino al giorno +14; in caso contrario è stata modificata la terapia sostituendola con regorafenib. L’efficacia del trattamento è stata valutata confrontando i volumi tumorali mentre i cambiamenti dell’elasticità tumorale sono stati studiati come predittori precoci di risposta alla terapia.

Studio ancora in corso (approvazione dello studio da parte del comitato etico nel 2016). Non è possibile fornire una solida interpretazione dei dati preliminari vista l’esigua numerosità campionaria.

Sonochemioterapia. Un nuovo approccio combinato di sonoporazione e chemioterapia

 La limitata efficacia della gemcitabina nei tumori epatici e biliari sembra essere correlata alla scarsa capacità di entrare nella cellula. Lo scopo del presente studio è quello di aumentare la concentrazione del farmaco a livello intracellulare utilizzando la sonoporazione, un fenomeno che consiste nella formazione di pori sulla membrana cellulare qualora vengano utilizzati ultrasuoni in associazione all’introduzione di microbolle nell’organismo. Tale fenomeno è stato già utilizzato nel capo della terapia genica ed antitumorale, sia a livello cellulare che in studi su modelli murini.

E’ stato quindi creato un modello murino sottocutaneo di carcinoma epatocellulare in entrambi i fianchi degli animali. Previa somministrazione di gemcitabina per via i.p., sono state sottoposte a sonoporazione solo le masse poste sul fianco destro, al fine di utilizzare quelle poste sul fianco sinistro come controllo. Tale procedura è stata eseguita il giorno 0, il giorno +5 e il giorno + 10 dal momento in cui le masse sono state considerate studiabili, ovvero avessero raggiunto almeno 4 mm di diametro. Il giorno + 10 gli animali sono stati sacrificati ancora sotto anestesia e le masse sono state prelevate per analisi immunoistochimiche e Western Blot.

I risultati preliminari suggeriscono una efficacia della sonoporazione nella terapia dell’HCC con gemcitabina in termini di minore crescita tumorale. Lo studio è ancora in corso ai fini di aumentare la numerosità campionaria.

Valutazione della risposta tumorale alla terapia con radio-embolizzazione dell'epatocarcinoma su cirrosi con invasione macrovascolare nell'ambito del normale percorso assistenziale.

Studio osservazionale prospettico di coorte monocentrico

Obiettivo: valutare valutare, in maniera sistematica e strutturata, la percentuale dei pazienti con epatocarcinoma in stadio localmente avanzato (caratterizzato dalla presenza di invasione vascolare tumorale macroscopica in assenza di malattia extra-epatica) con risposta radiologica completa e sostenuta al trattamento radio-embolizzante, ed il timing di ottenimento di tale risultato.

Obiettivi secondari: Valutare la necessità, in termini di frequenza, di trattamenti combinati (con chemio-embolizzazione, sorafenib, radiofrequenza ed alcolizzazione) per ottenere la risposta completa del tumore.

Studio prospettico approvato dal comitato etico ed in fase di arruolamento di pazienti

Studio osservazionale retrospettivo/prospettico di coorte: archivio elettronico dei pazienti affetti da epatocarcinoma in trattamento con sorafenib.

L’obiettivo è creare un archivio elettronico, multicentrico, di pazienti con diagnosi di HCC in trattamento o candidati al trattamento con sorafenib nell’ambito del normale percorso assistenziale.

Raccogliendo i dati clinici, laboratoristici e strumentali di tali pazienti sarà possibile: 1) monitorare l’efficacia e la sicurezza della terapia con sorafenib nei pazienti affetti da epatocarcinoma; 2) identificare parametri clinico-laboratoristici di risposta dell’HCC alla terapia con sorafenib; 3) valutare i fattori prognostici che aiutino il disegno di trials clinici con farmaci di seconda linea.

La raccolta dei dati avverrà attraverso la consultazione della cartella clinica ambulatoriale o di ricovero ospedaliero, dalla cui analisi verranno raccolti dati relativi all’anamnesi patologica remota e recente, riguardanti la comparsa di reazioni avverse farmaco-relate e la valutazione radiologica dell’efficacia della terapia. Verranno inoltre valutati i dati riguardanti il follow-up del paziente al termine della terapia sistemica con sorafenib.

Il database è stato creato ed aperto. Attualmente vi aderiscono 7 centri. La raccolta dati è tutt’ora aperta. Abbiamo iniziato una elaborazione sui circa 500 pazienti inseriti relativa alle caratteristiche dei pazienti long term responders ed una altra sulle sopravvivenze dei pazienti dopo terapia con sorafenib.

Epatologia clinica

Studio retrospettivo sulla storia naturale della trombosi portale in cirrosi epatica.

Studio retrospettivo sulla storia naturale della trombosi portale in cirrosi epatica. (Pettinari I, Landi S, Piscaglia F)

Lo studio promosso dall’ UO Medicina Interna Bolondi ha coinvolto anche altre Unità Operative dell’Azienda S.Orsola-Malpighi ed è stato rivolto a verificare l’andamento della trombosi portale (progressione, stabilità, regressione, eventuali insorgenza di complicazioni da ipertensione portale) in relazione ai fattori clinici. Questi comprendono molteplici variabili quali ad esempio stato di funzione epatica, terapia anticoagulante, livelli di piastrine, tempo intercorso tra esordio di malattia ed inizio terapia anticoagulante. Lo studio è multicentrico internazionale ed ha visto anche il coinvolgimento dei colleghi della Gastroenterologia dell’Università di Cluj Napoca in Romania.

Sono stati identificati ed analizzati un totale di 182 pazienti che rispettvano i criteri di inclusione/esclusione. Di questi 81 erano stati trattati con anticoagulanti e 101 no. L’estensione della trombosi portale si è ridotta in 46 (56.8%) dei pazienti trattati in 26 (25.7%) dei non trattati. Il tasso di ricanalizzazione del sistema portale è risultato significativamente maggiore nei trattati (p <0.001). Dei 46 pazienti che avevamo raggiunto una ricanalizzazione 17 (36%) hanno sofferto una recidiva di trombosi dopo la sospensione della terapia anticoagulante. L’analisi con curve di Kaplan–Meier ha mostrato un maggior tasso di sopravvivenza nei pazienti trattati che nei non trattati (p=0,010). Il trattamento anticoagulante è risultato l’unico fattore associato in modo indipendente con la sopravvivenza all’analisi multivariata (p=0,014, HR:0,303, CI: 0.101-0.907). I dati sono stati oggetti di tesi di dottorato della dr.ssa Irene Pettinari e sono in programma di essere sottoposti a rivista per possibile pubblicazione.

Valutazione dell’espressione tissutale della lipasi acida lisosomiale nei pazienti NAFLD resecati per epatocarcinoma

La valutazione dell’espressione tissutale epatica della lipasi acida lisosomiale mediante tecnica di immunofluorescenza su pezzi chirurgici di pazienti NAFLD resecati per epatocarcinoma offrirebbe la possibilità di valutare un possibile ruolo del deficit epatico di tale enzima sulla carcinogenesi (particolarmente interessante nei pazienti con HCC su fegato non cirrotico). Lo studio creerebbe una possibile collaborazione con l’Anatomia Patologica ed eventualmente la Chirurgia. Inoltre si tratterebbe di uno studio a costo contenuto in cui la NAFLD/NASH è istologicamente confermata.

Infine, per i pazienti viventi e già arruolati nello studio sulla lipasi acida lisosomiale sierica vi sarebbe la possibilità di confronti tra valori rilevati su sangue e su tessuto. In attesa di sottomissione al CE

Malattia celiaca e malattie glutine-relate

Studio BIOMaCe: Identificazione e validazione di BIOmarcatori di diagnosi precoce, prognosi e risposta al trattamento nella malattia celiaca e nella sensibilità al glutine non celiaca. Studio finanziato dalla Fondazione del Monte di bologna e Ravenna

Lo studio si propone di identificare e selezionare un panel di micro-RNA con significatività statistica e/o rilevanza biologica nella diagnosi di malattia celiaca e sensibilità al glutine non celiaca, al fine di:

-migliorare il percorso diagnostico

-identificare parametri molecolari predittivi di prognosi

In particolare ci si propone di identificare biomarcatori circolanti che possano contribuire a:

-diagnosi precoce di pazienti con sospetta patologia correlata al glutine non caratterizzabili in modo definitivo con le sole tecniche di diagnostica disponibili

-valutazione prognostica

-identificazione di risposta precoce al trattamento

Campioni raccolti 76 inclusivi dei controlli

Studio multicentrico italiano sull’adenocarcinoma del tenue: caratteristiche clinico-patologiche, molecolari e prognostiche.

 

Data la rarità e le scarsissime conoscenze scientifiche disponibili a tutt’oggi sull’adenocarcinoma dell’intestino tenue (ACT) (incidenza 5,7 casi per milione di persone) è stato creato uno studio retrospettivo multicentrico a livello italiano per aumentare il più possibile il numero della casistica studiata. Ci si è voluti concentrare in particolare sui casi di adenocarcinoma del tenue non-familiare, ovvero insorto in soggetti con malattia celiaca o morbo di Crohn. Partecipano a questo studio 20 centri italiani di terzo livello per la malattia celiaca e/o di malattie infiammatorie croniche intestinali che sono riusciti ad individuare in totale 51 casi di ACT (26 casi insorti su celiachia e 25 su M. Crohn). Verranno analizzati i dati epidemiologici, clinici, molecolari, istopatologici e di sopravvivenza di questi soggetti e confrontati con i pochissimi dati attualmente disponibili in letteratura su casistiche di ACT miste (comprendenti sia i familiari che quelli non familiari).

Risposta clinica e persistenza dei sintomi in pazienti con sensibilità al grano non-celiaca dopo 4 anni di dieta senza glutine

Il quadro clinico della sensibilità al grano non celiaca (NCWS) al momento della diagnosi è noto da precedenti studi multicentrici e da due trial in doppio cieco che hanno verificato le modifiche dei sintomi e della qualità di vita a distanza di un periodo massimo di 2 settimane di dieta senza glutine. Non è tuttora noto l’impatto a lungo termine di tale dieta né sui sintomi né sulla qualità di vita.

Lo studio, che deriva dai dati raccolti nella tesi di laurea della dott.ssa Negrini, mira a valutare questi aspetti. Dai risultati emerge che i pazienti NCWS, rispetto ai pazienti celiaci, presentano una maggiore frequenza di sintomi intestinali ed extraintestinali residui (65% vs 32%, p<0.001). Questi disturbi sono in massima parte di lieve entità e non impattano sulla qualità di vita, che è simile nei due gruppi. E’ probabile che buona parte dei sintomi residui sia ascrivibile alla persistenza di FODMAPs nella dieta e che pertanto questi pazienti necessitino di una valutazione nutizionale ancora più attenta che i pazienti celiaci.