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Anna Tinti

Professoressa Alma Mater

Alma Mater Studiorum - Università di Bologna

Professoressa a contratto

Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche

Temi di ricerca

Ricerche attuali:

  • Caratterizzazione spettroscopica di nuovi biomateriali (oligopeptidi autoassemblanti) e la loro bioattività;
  • determinazione della struttura secondaria e terziaria di proteine (in particolare albumina umana e bovina, lattoglobulina e metallotioneine) e delle loro interazioni con metalli;
  • caratterizzazione spettroscopica struttura-proprietà di polimorfi di farmaci.

Ricerche precedenti:

  • studio in vitro di nuovi cementi endodontici derivati dal cemento Portland;
  • determinazione del grado di cristallinità e ossidazione di componenti di protesi in UHMWPE (polietilene crosslinkato e Hylamer), che sono indici strettamente correlati con la biocompatibilità del polimero;
  • studi vibrazionali della degradazione di compositi polimero/apatite per tissue engineering.




1. Caratterizzazione spettroscopica di nuovi biomateriali e della loro bioattività.

a. Determinazione della struttura secondaria e interazioni inter- e intra-molecolari di peptidi autoassemblanti per tissue engineering.

Per quanto riguarda la caratterizzazione spettroscopica di nuovi biomateriali,sono proseguiti gli studi, iniziati nell'ambito di un progetto PRIN, sulla struttura secondaria di oligopeptidi auto aggreganti o lego-peptidi, sintetizzati presso l'Istituto dei Processi Chimici di Ingegneria dell'Università di Padova (prof. Dettin), da utilizzare come coating di metalli (Titanio) per ottenere una risposta cellulare delle cellule osteoblastiche che favorisca la rigenerazione tissutale. Il capostipite di questi olipeptidi (pept1, meglio noto come EAK-16, (AEAEAKAK)2,) contiene a.a. carichi (glu, lys) intervallati da a.a. neutri apolari (ala), e si aggrega con struttura prevalentemente beta-sheet. Il gruppo di Padova ha sintetizzato nuovi oligopeptidi con sostituzione non solo acida (glu /asp), basica (lys/orn) o entrambi, ma anche dello spaziatore apolare (ala /alfa-amminobutirrico e ala /tyr). Inoltre, in due di essi è stata aggiunta la sequenza RGD (arg, gly, asp), importante per l'adesione cellulare. Il primo dei peptidi contenenti la sequenza RGD (pept7) mantiene la sequenza del capostipite, mentre nel secondo gli a.a. presentano una disposizione casuale (pept8). In totale, i peptidi sintetizzati dalla prof. Dettin dell'università di Padova erano 8 e tutti sono stati caratterizzati mediante la spettroscopia vibrazionale IR e Raman sia a livello macroscopico che a livello microscopico.

I peptidi sono stati esaminati sia subito dopo la sintesi che in condizioni diverse di pH e concentrazione di sali, che favoriscono l'aggregazione dei peptidi in forma beta-sheet (in particolare NaCl a pH fisiologico). Infatti, mentre per i peptidi appena sintetizzati l'indagine spettroscopica ha permesso di stabilire che l'EAK-16 e i peptidi con sostituzione acida, basica o dello spaziatore apolare mostravano una netta prevalenza di struttura beta-sheet (dell'ordine del 70%), il pept7 presentava ancora come prevalente la struttura beta-sheet, ma con percentuale minore (circa il 50%) mentre il pept8 mostrava una netta prevalenza di struttura alfa/random. Per quanto riguarda i peptidi solubilizzati in NaCl a pH fisiologico e poi liofilizzati, mentre i peptidi con sostituzione acida, basica o dello spaziatore apolare non cambiavano la prevalenza di struttura beta-sheet, seppur con leggero aumento, in alcuni casi, della percentuale di alfa-elica a scapito della struttura random, sia il pept7 che il pept8 aumentavano notevolmente la loro percentuale di struttura beta-sheet, almeno qualitativamente. 

Sono stati poi esaminati gli stessi oligopeptidi depositati su matrici di TiO2 per determinare sia la loro struttura secondaria che il grado di aggregazione dopo deposizione sulla superficie di metallo rugoso, quindi in condizioni di uso come biomateriali. E' infatti importante stabilire quali peptidi riescano ad aggregarsi con struttura omogenea beta-sheet, che favorisce la capacità di formare strati su superfici solide, e in particolare come si comportano i peptidi contenenti la sequenza RGD, al fine di ottenere una superficie del biomateriale adeguata per l'attacco di cellule della matrice ossea e per la loro proliferazione. E' inoltre importante determinare in quale modo i peptidi si ancorino alla superficie. Le misure di micro-IR e micro-Raman hanno mostrato che solo alcuni dei peptidi si aggregano con una struttura regolare beta-sheet e sono quindi adatti per aderire come strato omogeneo sul titanio ossidato. Tali peptidi sono: pept1, pept5 (sostituzione ala con acido alfa-amminobutirrico, cioè allungamento della catena dell'a.a. apolare) e pept7 (presenza di RGD, ma con il resto della struttura uguale al pept1), mentre altri peptidi (sostituzioni acide e basiche con a.a. più corti o disposizione casuale degli a.a. + RGD) non si dispongono uniformemente sul TiO2 e quindi sono inadeguati allo scopo. I peptidi che si dispongono uniformemente sul titanio mantengono, anche in questo caso, una prevalenza di struttura beta, seppur meno pronunciata di quella osservata per lo stesso peptide dopo solubilizzazione in NaCl e liofilizzazione. In conclusione, la sostituzione degli a.a. polari ha influenzato l'abilità dei peptidi di auto assemblarsi molto di più dell'aggiunta della sequenza RGD, importante per l'adesione cellulare.

 La metodica di indagine ha anche permesso di stabilire che tutti i peptidi si ancorano al Ti formando dei chelati a ponte tra i gruppi –COO- del peptide e la superficie; inoltre, anche il C=O del gruppo ammidico interagisce con la superficie del metallo. 

Infine, è stato svolto uno studio della struttura dei peptidi dopo trattamento con radiazioni in ambiente ossidante, analogo a quello biologico. Infatti i processi di crescita cellulare sono strettamente associati alla formazione di radicali liberi, spesso derivanti dall'ossigeno (ROS),  che sono implicati nello sviluppo di varie malattie e nei processi di invecchiamento. In particolare, il radicale ossidrilico, .OH, è considerato una delle specie ossidative più reattive e pertanto più dannose. Si è osservato che alcuni dei peptidi sintetizzati sono più resistenti ai trattamenti con radiazioni e si sta lavorando per spiegare questo comportamento e per stabilire fino a quale dose di radiazione questi peptidi conservano la loro struttura secondaria senza modificarsi.

2. determinazione della struttura secondaria e terziaria di proteine (in particolare albumina umana e bovina, lattoglobulina e metallotioneine) e delle loro interazioni con metalli

Le metallotioneine (MT) sono proteine a basso peso molecolare, ampiamente presenti in tessuti animali e vegetali, caratterizzate da un alto contenuto di residui di cisteina e metalli. Nelle MT le cisteine si legano ad un ampia gamma di metalli (M) mediante il gruppo tiolato dando origine a complessi M-MT con varie stechiometrie. Oltre agli oligoelementi essenziali Zn e Cu, le MTs possono legare metalli pesanti tossici come Cd e Hg. Per questa ragione è stata proposta per le MT una funzione di omeostasi e detossificazione dei metalli, sebbene la loro definitiva funzione fisiologica sia ancora dibattuta. Nonostante finora siano state determinate numerosissime sequenze di MT, le loro proprietà strutturali e funzionali sono ancora largamente sconosciute; la struttura tridimensionale dei complessi M-MT è infatti nota solo per un piccolo numero di MT. La sfera di coordinazione di M può essere completata da altri legandi (Cl- e S2-) che possono contribuire alla struttura e stabilità di alcuni sistemi M-MT. Ad esempio gli ioni S2- hanno un ruolo importante nella detossificazione del Cd dal momento che la loro incorporazione nei complessi aumenta sia la stabilità dei sistemi M-MT sia la quantità di Cd presenti in essi. Per capire meglio la capacità delle MT di legare ioni metallici e la struttura delle specie formatisi, verrà effettuato un approfondito studio vibrazionale dei complessi costituiti da MT di diversa origine (piante, protozoi, invertebrati) e metalli di transizione (Zn, Cd, Cu). Infatti la spettroscopia vibrazionale, in particolare quella Raman, è uno strumento molto utile nell'identificazione delle conformazioni proteiche e nel fornire informazioni sui siti coinvolgenti lo zolfo. E' possibile inoltre individuare altri siti di legame coinvolti nella coordinazione del metallo (es. COO-, N-imidazolico) mediante l'analisi delle bande caratteristiche delle catene laterali di alcuni amminoacidi. Per valutare l'effetto del metallo sulla struttura globale della proteina, verranno studiati complessi delle MT con diversi metalli di transizione; sarà analizzato anche l'effetto di sequenze contenenti quantità diverse di amminoacidi capaci di chelare i metalli allo scopo di individuare una relazione con la struttura tridimensionale delle specie M-MT.

Inoltre, sono state svolte misure di spettroscopia FT-Raman, FT-IR e di dynamic light scattering su proteine come l'albumina bovina (BSA) e la lattoglobulina, per identificare le dimensioni ed il tipo di aggregati a cui possono dare origine per effetto di un aumento di temperatura in presenza di metalli quali Zn e Cu. Questi studi avevano lo scopo di evidenziare cambiamenti di struttura secondaria della proteina (da alfa-elica a beta-sheet o vice-versa) e di identificare i residui di amminoacidici coinvolti nel complesso che chela il metallo. I risultati ottenuti nel caso dell'albumina hanno evidenziato che sia in assenza che in presenza di ioni metallici l'aumento di temperatura favoriva la struttura beta-sheet rispetto all'alfa-elica per la BSA. Il cambiamento di struttura secondaria della proteina non cambiava particolarmente in presenza di ioni Zn o Cu. Si è comunque osservato che la presenza di Zn (II) promuoveva la formazione di aggregati di dimensioni maggiori. La spettroscopia Raman ha permesso di evidenziare il ruolo dell'a.a. istidina nel chelare il metallo e anche il fatto che nel caso del Cu(II) si formino chelati intramolecolari con scarsa crescita della dimensione degli aggregati, paragonabili come dimensioni a quelli osservati in assenza del metallo, mentre nel caso dello Zn(II) si formano degli aggregati a ponte  His(Nt)-Zn(II)–His(Nt) intermolecolari, che favoriscono la crescita degli aggregati stessi. La spettroscopia Raman ha quindi permesso di spiegare dal punto di vista della struttura della proteina le osservazione di dynamic light scattering.

3. caratterizzazione spettroscopica struttura-proprietà di polimorfi di farmaci di uso comune quali il cloramfenicolo palmitato, il tamoxifene citrato e l'acetazolammide.

Il polimorfismo è in effetti molto importante per i composti farmaceutici perché la presenza di polimorfi diversi può inficiare la stabilità chimica e le proprietà delle formulazioni farmaceutiche. Risulta quindi fondamentale poter determinare la presenza e quantità relativa di diversi polimorfi in una miscela. Nel caso del cloramfenicolo palmitato sono stati identificati, tramite la spettroscopia Raman, tre diversi polimorfi di cui 1 attivo farmacologicamente, uno inattivo e l'ultimo instabile. Le formulazioni farmaceutiche richiedono la presenza di non più del 10% di forma inattiva. E' stata perciò preparata una miscela contenente il 10% di forma inattiva e dal suo spettro Raman è stato possibile identificare due zone spettrali idonee a uno studio quantitativo. Miscele contenenti dal 2 al 12% di forma inattiva nella forma attiva hanno permesso di stabilire una relazione lineare tra area delle bande tipiche della forma inattiva e la sua concentrazione, rendendo quindi possibile una determinazione quantitativa del polimorfo inattivo nel range di concentrazione importante per uso farmaceutico.

Nello studio sui polimorfi del tamoxifene citrato la spettroscopia IR ha permesso di evidenziare le differenze presenti nel gruppo citrato per i tre diversi polimorfi. Nel primo caso un gruppo -COOH è salificato e gli altri due, equivalenti, non lo sono; nel secondo caso si notano un gruppo acido salificato e due -COOH non equivalenti che formano legami a idrogeno sotto forma di dimeri; infine nel terzo polimorfo si nota la presenza di una discreta quantità di acqua adsorbita e, come per il polimorfo 2, un gruppo acido è salificato mentre gli altri due sono equivalenti e coinvolti, tramite legame idrogeno, nella formazione di due diversi dimeri. La spettroscopia Raman permette invece di evidenziare meglio le bande tipiche degli anelli aromatici del tamoxifene, identificando bande tipiche dei diversi polimorfi, in particolare per quanto riguarda gli anelli benzenici mono- e para-sostituiti.

Nel caso dell'acetazolammide, in letteratura sono noti due polimorfi del farmaco (forma A, stabile a temperatura ambiente, e forma B). Finora però una dettagliata assegnazione spettroscopica delle bande IR e Raman di questo composto non era stata fatta, così come erano noti solo studi parziali sui due polimorfi. E' stato quindi condotto uno studio per identificare i due polimorfi per mezzo, oltre che delle spettroscopie IR e micro-Raman, anche delle tecniche  di  Hot-stage Raman, diffrazione a Raggi-X e calorimetria differenziale a scansione (DSC). La forma A dell'acetazolammide è stata macinata per tempi diversi, ottenendo così una diversa granulometria e i campioni di polvere sono stati sottoposti ad analisi  IR e DSC. Il processo di macinatura, diminuendo la dimensione delle particelle, ha indotto una trasformazione del farmaco dal polimorfo A al polimorfo B. Per determinare la percentuale di polimorfo B nel polimorfo A è stata anche fatta una curva di calibrazione, tramite spettroscopia FT-Raman, delle diverse percentuali di polimorfo. Tale curva di calibrazione permette di ottenere un'analisi quantitativa dei due polimorfi del farmaco. Un altro farmaco di cui sono stati studiati i diversi polimorfi tramite misure di spettroscopia IR e Raman (corredate di calcoli teorici per l'attribuzione delle bande osservate negli spettri dei polimorfi), raggi X e termogravimetria è stata l'ampicillina.

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