Ricerche attuali:
- Caratterizzazione spettroscopica di nuovi biomateriali
(oligopeptidi autoassemblanti) e la loro bioattività;
- determinazione della struttura secondaria e terziaria di
proteine (in particolare albumina umana e bovina, lattoglobulina e
metallotioneine) e delle loro interazioni con metalli;
- caratterizzazione spettroscopica struttura-proprietà di
polimorfi di farmaci.
Ricerche precedenti:
- studio in vitro di nuovi cementi endodontici derivati dal cemento Portland;
- determinazione del grado di cristallinità e ossidazione di
componenti di protesi in UHMWPE (polietilene crosslinkato e
Hylamer), che sono indici strettamente correlati con la
biocompatibilità del polimero;
- studi vibrazionali della degradazione di compositi
polimero/apatite per tissue engineering.
1. Caratterizzazione spettroscopica di nuovi biomateriali e
della loro bioattività.
a. Determinazione della struttura secondaria e interazioni
inter- e intra-molecolari di peptidi autoassemblanti per tissue
engineering.
Per quanto riguarda la caratterizzazione spettroscopica di
nuovi biomateriali,sono proseguiti gli studi, iniziati
nell'ambito di un progetto PRIN, sulla struttura secondaria di
oligopeptidi auto aggreganti o lego-peptidi, sintetizzati
presso l'Istituto dei Processi Chimici di Ingegneria
dell'Università di Padova (prof. Dettin), da utilizzare come
coating di metalli (Titanio) per ottenere una risposta cellulare
delle cellule osteoblastiche che favorisca la rigenerazione
tissutale. Il capostipite di questi olipeptidi (pept1, meglio noto
come EAK-16, (AEAEAKAK)2,) contiene a.a. carichi (glu, lys)
intervallati da a.a. neutri apolari (ala), e si aggrega con
struttura prevalentemente beta-sheet. Il gruppo di Padova ha
sintetizzato nuovi oligopeptidi con sostituzione non solo acida
(glu /asp), basica (lys/orn) o entrambi, ma anche dello spaziatore
apolare (ala /alfa-amminobutirrico e ala /tyr). Inoltre, in due di
essi è stata aggiunta la sequenza RGD (arg, gly, asp), importante
per l'adesione cellulare. Il primo dei peptidi contenenti la
sequenza RGD (pept7) mantiene la sequenza del capostipite, mentre
nel secondo gli a.a. presentano una disposizione casuale (pept8).
In totale, i peptidi sintetizzati dalla prof. Dettin
dell'università di Padova erano 8 e tutti sono stati caratterizzati
mediante la spettroscopia vibrazionale IR e Raman sia a livello
macroscopico che a livello microscopico.
I peptidi sono stati esaminati sia subito dopo la sintesi che in
condizioni diverse di pH e concentrazione di sali, che favoriscono
l'aggregazione dei peptidi in forma beta-sheet (in particolare NaCl
a pH fisiologico). Infatti, mentre per i peptidi appena
sintetizzati l'indagine spettroscopica ha permesso di stabilire che
l'EAK-16 e i peptidi con sostituzione acida, basica o dello
spaziatore apolare mostravano una netta prevalenza di struttura
beta-sheet (dell'ordine del 70%), il pept7 presentava ancora come
prevalente la struttura beta-sheet, ma con percentuale minore
(circa il 50%) mentre il pept8 mostrava una netta prevalenza di
struttura alfa/random. Per quanto riguarda i peptidi solubilizzati
in NaCl a pH fisiologico e poi liofilizzati, mentre i peptidi con
sostituzione acida, basica o dello spaziatore apolare non
cambiavano la prevalenza di struttura beta-sheet, seppur con
leggero aumento, in alcuni casi, della percentuale di alfa-elica a
scapito della struttura random, sia il pept7 che il pept8
aumentavano notevolmente la loro percentuale di struttura
beta-sheet, almeno qualitativamente.
Sono stati poi esaminati gli stessi oligopeptidi depositati su
matrici di TiO2 per determinare sia la loro struttura secondaria
che il grado di aggregazione dopo deposizione sulla superficie di
metallo rugoso, quindi in condizioni di uso come biomateriali. E'
infatti importante stabilire quali peptidi riescano ad aggregarsi
con struttura omogenea beta-sheet, che favorisce la capacità di
formare strati su superfici solide, e in particolare come si
comportano i peptidi contenenti la sequenza RGD, al fine di
ottenere una superficie del biomateriale adeguata per l'attacco di
cellule della matrice ossea e per la loro proliferazione. E'
inoltre importante determinare in quale modo i peptidi si ancorino
alla superficie. Le misure di micro-IR e micro-Raman hanno mostrato
che solo alcuni dei peptidi si aggregano con una struttura regolare
beta-sheet e sono quindi adatti per aderire come strato omogeneo
sul titanio ossidato. Tali peptidi sono: pept1, pept5 (sostituzione
ala con acido alfa-amminobutirrico, cioè allungamento della catena
dell'a.a. apolare) e pept7 (presenza di RGD, ma con il resto della
struttura uguale al pept1), mentre altri peptidi (sostituzioni
acide e basiche con a.a. più corti o disposizione casuale degli
a.a. + RGD) non si dispongono uniformemente sul TiO2 e quindi sono
inadeguati allo scopo. I peptidi che si dispongono uniformemente
sul titanio mantengono, anche in questo caso, una prevalenza di
struttura beta, seppur meno pronunciata di quella osservata per lo
stesso peptide dopo solubilizzazione in NaCl e liofilizzazione. In
conclusione, la sostituzione degli a.a. polari ha influenzato
l'abilità dei peptidi di auto assemblarsi molto di più
dell'aggiunta della sequenza RGD, importante per l'adesione
cellulare.
La metodica di indagine ha anche permesso di stabilire che
tutti i peptidi si ancorano al Ti formando dei chelati a ponte tra
i gruppi –COO- del peptide e la superficie; inoltre, anche il C=O
del gruppo ammidico interagisce con la superficie del
metallo.
Infine, è stato svolto uno studio della struttura dei peptidi
dopo trattamento con radiazioni in ambiente ossidante, analogo a
quello biologico. Infatti i processi di crescita cellulare sono
strettamente associati alla formazione di radicali liberi, spesso
derivanti dall'ossigeno (ROS), che sono implicati nello
sviluppo di varie malattie e nei processi di invecchiamento. In
particolare, il radicale ossidrilico, .OH, è considerato una
delle specie ossidative più reattive e pertanto più dannose. Si è
osservato che alcuni dei peptidi sintetizzati sono più resistenti
ai trattamenti con radiazioni e si sta lavorando per spiegare
questo comportamento e per stabilire fino a quale dose di
radiazione questi peptidi conservano la loro struttura secondaria
senza modificarsi.
2.
determinazione della struttura secondaria e terziaria di
proteine (in particolare albumina umana e bovina, lattoglobulina e
metallotioneine) e delle loro interazioni con metalli
Le metallotioneine (MT) sono proteine a basso peso molecolare,
ampiamente presenti in tessuti animali e vegetali, caratterizzate
da un alto contenuto di residui di cisteina e metalli. Nelle MT le
cisteine si legano ad un ampia gamma di metalli (M) mediante il
gruppo tiolato dando origine a complessi M-MT con varie
stechiometrie. Oltre agli oligoelementi essenziali Zn e Cu, le MTs
possono legare metalli pesanti tossici come Cd e Hg. Per questa
ragione è stata proposta per le MT una funzione di omeostasi e
detossificazione dei metalli, sebbene la loro definitiva funzione
fisiologica sia ancora dibattuta. Nonostante finora siano state
determinate numerosissime sequenze di MT, le loro proprietà
strutturali e funzionali sono ancora largamente sconosciute; la
struttura tridimensionale dei complessi M-MT è infatti nota solo
per un piccolo numero di MT. La sfera di coordinazione di M può
essere completata da altri legandi (Cl- e S2-) che possono
contribuire alla struttura e stabilità di alcuni sistemi M-MT. Ad
esempio gli ioni S2- hanno un ruolo importante nella
detossificazione del Cd dal momento che la loro incorporazione nei
complessi aumenta sia la stabilità dei sistemi M-MT sia la quantità
di Cd presenti in essi. Per capire meglio la capacità delle MT di
legare ioni metallici e la struttura delle specie formatisi, verrà
effettuato un approfondito studio vibrazionale dei complessi
costituiti da MT di diversa origine (piante, protozoi,
invertebrati) e metalli di transizione (Zn, Cd, Cu). Infatti la
spettroscopia vibrazionale, in particolare quella Raman, è uno
strumento molto utile nell'identificazione delle conformazioni
proteiche e nel fornire informazioni sui siti coinvolgenti lo
zolfo. E' possibile inoltre individuare altri siti di legame
coinvolti nella coordinazione del metallo (es. COO-, N-imidazolico)
mediante l'analisi delle bande caratteristiche delle catene
laterali di alcuni amminoacidi. Per valutare l'effetto del metallo
sulla struttura globale della proteina, verranno studiati complessi
delle MT con diversi metalli di transizione; sarà analizzato anche
l'effetto di sequenze contenenti quantità diverse di amminoacidi
capaci di chelare i metalli allo scopo di individuare una relazione
con la struttura tridimensionale delle specie M-MT.
Inoltre, sono state svolte misure di spettroscopia FT-Raman,
FT-IR e di dynamic light scattering su proteine come l'albumina
bovina (BSA) e la lattoglobulina, per identificare le dimensioni ed
il tipo di aggregati a cui possono dare origine per effetto di un
aumento di temperatura in presenza di metalli quali Zn e Cu. Questi
studi avevano lo scopo di evidenziare cambiamenti di struttura
secondaria della proteina (da alfa-elica a beta-sheet o vice-versa)
e di identificare i residui di amminoacidici coinvolti nel
complesso che chela il metallo. I risultati ottenuti nel caso
dell'albumina hanno evidenziato che sia in assenza che in presenza
di ioni metallici l'aumento di temperatura favoriva la struttura
beta-sheet rispetto all'alfa-elica per la BSA. Il cambiamento di
struttura secondaria della proteina non cambiava particolarmente in
presenza di ioni Zn o Cu. Si è comunque osservato che la presenza
di Zn (II) promuoveva la formazione di aggregati di dimensioni
maggiori. La spettroscopia Raman ha permesso di evidenziare il
ruolo dell'a.a. istidina nel chelare il metallo e anche il fatto
che nel caso del Cu(II) si formino chelati intramolecolari con
scarsa crescita della dimensione degli aggregati, paragonabili come
dimensioni a quelli osservati in assenza del metallo, mentre nel
caso dello Zn(II) si formano degli aggregati a ponte
His(Nt)-Zn(II)–His(Nt) intermolecolari, che favoriscono la crescita
degli aggregati stessi. La spettroscopia Raman ha quindi permesso
di spiegare dal punto di vista della struttura della proteina le
osservazione di dynamic light scattering.
3. caratterizzazione spettroscopica struttura-proprietà di
polimorfi di farmaci di uso comune quali il cloramfenicolo
palmitato, il tamoxifene citrato e l'acetazolammide.
Il polimorfismo è in effetti molto importante per i composti
farmaceutici perché la presenza di polimorfi diversi può inficiare
la stabilità chimica e le proprietà delle formulazioni
farmaceutiche. Risulta quindi fondamentale poter determinare la
presenza e quantità relativa di diversi polimorfi in una miscela.
Nel caso del cloramfenicolo palmitato sono stati identificati,
tramite la spettroscopia Raman, tre diversi polimorfi di cui 1
attivo farmacologicamente, uno inattivo e l'ultimo instabile. Le
formulazioni farmaceutiche richiedono la presenza di non più del
10% di forma inattiva. E' stata perciò preparata una miscela
contenente il 10% di forma inattiva e dal suo spettro Raman è stato
possibile identificare due zone spettrali idonee a uno studio
quantitativo. Miscele contenenti dal 2 al 12% di forma inattiva
nella forma attiva hanno permesso di stabilire una relazione
lineare tra area delle bande tipiche della forma inattiva e la sua
concentrazione, rendendo quindi possibile una determinazione
quantitativa del polimorfo inattivo nel range di concentrazione
importante per uso farmaceutico.
Nello studio sui polimorfi del tamoxifene citrato la
spettroscopia IR ha permesso di evidenziare le differenze presenti
nel gruppo citrato per i tre diversi polimorfi. Nel primo caso un
gruppo -COOH è salificato e gli altri due, equivalenti, non lo
sono; nel secondo caso si notano un gruppo acido salificato e due
-COOH non equivalenti che formano legami a idrogeno sotto forma di
dimeri; infine nel terzo polimorfo si nota la presenza di una
discreta quantità di acqua adsorbita e, come per il polimorfo 2, un
gruppo acido è salificato mentre gli altri due sono equivalenti e
coinvolti, tramite legame idrogeno, nella formazione di due diversi
dimeri. La spettroscopia Raman permette invece di evidenziare
meglio le bande tipiche degli anelli aromatici del tamoxifene,
identificando bande tipiche dei diversi polimorfi, in particolare
per quanto riguarda gli anelli benzenici mono- e
para-sostituiti.
Nel caso dell'acetazolammide, in letteratura sono noti due
polimorfi del farmaco (forma A, stabile a temperatura ambiente, e
forma B). Finora però una dettagliata assegnazione spettroscopica
delle bande IR e Raman di questo composto non era stata fatta, così
come erano noti solo studi parziali sui due polimorfi. E' stato
quindi condotto uno studio per identificare i due polimorfi per
mezzo, oltre che delle spettroscopie IR e micro-Raman, anche delle
tecniche di Hot-stage Raman, diffrazione a Raggi-X e
calorimetria differenziale a scansione (DSC). La forma A
dell'acetazolammide è stata macinata per tempi diversi, ottenendo
così una diversa granulometria e i campioni di polvere sono stati
sottoposti ad analisi IR e DSC. Il processo di macinatura,
diminuendo la dimensione delle particelle, ha indotto una
trasformazione del farmaco dal polimorfo A al polimorfo B. Per
determinare la percentuale di polimorfo B nel polimorfo A è stata
anche fatta una curva di calibrazione, tramite spettroscopia
FT-Raman, delle diverse percentuali di polimorfo. Tale curva di
calibrazione permette di ottenere un'analisi quantitativa dei due
polimorfi del farmaco. Un altro farmaco di cui sono stati studiati
i diversi polimorfi tramite misure di spettroscopia IR e Raman
(corredate di calcoli teorici per l'attribuzione delle bande
osservate negli spettri dei polimorfi), raggi X e termogravimetria
è stata l'ampicillina.