72569 - BIOLOGIA MOLECOLARE DEGLI EUCARIOTI CON LABORATORIO

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso, lo studente conosce i principali meccanismi di regolazione dell'espressione genica nei procarioti e negli eucarioti, con approfondimenti mirati riguardanti la regolazione trascrizionale e gli RNA regolatori. In particolare, lo studente è in grado di: - analizzare e discutere con padronanza argomenti di regolazione dell' espressione genica; - proporre strategie di indagine dell'espressione genica; - comprendere e analizzare criticamente la letteratura biomolecolare in tutti i suoi aspetti; - progettare approcci sperimentali dettagliati su problematiche generali di carattere biomolecolare.

Contenuti

1. Organismi modello per lo studio della funzione genica. Introduzione al C.elegans e al fenomeno dell'interferenza dell'RNA (RNAi).

RNAi: interferenza genica da RNA a doppio filamento (dsRNA) in C.elegans. dsRNA dirige la digestione dell'mRNA ad intervalli di 21-23 nucleotidi. RNAi e' mediata da RNA di 21-22 nucleotidi.

Ruolo di Dicer nell'inizio dell'RNAi. I geni e i meccanismi dell'RNAi regolano l'espressione degli stRNA di C.elegans. Clonaggio e caratterizzazione dei miRNA. Asimmetria del complesso RISC. Basi molecolari per il riconoscimento dei pri-miRNA da parte del complesso Drosha/DGCR8.

Progettare e utilizzare sperimentalmente shRNA e siRNA. Tecniche e controlli sperimentali

Le proteine della famiglia Argonauta.

La famiglia dei piccoli RNA silenziatori: miRNA, siRNA e piRNA. Meccanismi di biogenesi dei piRNA.

Meccanismi di regolazione post-trascrizionale da miRNA.

Trascrizione e RNAi nella formazione dell'eterocromatina.

2. La complessita' del Proteoma. Le modificazioni post-traduzionali delle proteine. Tecniche per lo studio delle proteine: anticorpi, elettroforesi bidimensionale, identificazione delle proteine mediante spettrofotometria di massa. Tecniche sperimentali per lo studio delle interazioni tra proteine: il sistema a due ibridi in lievito, GST- pull down, co-immunoprecipitazione, purificazione TAP-TAG.

3. La scoperta dell'Ubiquitina (Ub). L'ubiquitinazione delle proteine: la cascata enzimatica. Significato funzionale della mono- e poli-Ubiquitinazione. Le proteine UBD che legano l'Ub.

4. La famiglia delle proteine SUMO. La cascata enzimatica della sumoilazione. Consensi di sumoilazione canonici e non-canonici. Significato funzionale della sumoilazione e possibili modelli di funzionamento.

Saggi di sumoilazione in vivo e in vitro.

Testi/Bibliografia

Non e' richiesto l'uso di un libro di testo. Il corso si basa su articoli scientifici e altro materiale che viene inviato agli studenti mediante posta elettronica.

Fire et al. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811.
Zamore et al (2000). RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleoide Intervals. Cell 101, 25-33.
Berstein et al (2001). Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 409, 363-366.
Schwarz et al. (2003). Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell 115, 199-208.
Grishok et al (2001). Genes and Mechanisms Related to RNA Interference Regulate Expression of the Small Temporal RNAs that Control C. elegans Developmental Timing. Cell 106, 23-34.
Han et al (2006). Molecular basis for the recognition of primary microRNAs by the Drosha-DGCR8 complex. Cell 125, 887-901.
Buhler et al (2006). Tethering RITS to a nascent transcript initiates RNAi- and heterochromatin-dependent gene silencing. Cell 125, 873-886.
Ghildiyal and Zamore (2009). Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108.
Rana (2007). Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs. Nature Reviews Mol Cell Biol. 8, 23-36.
Filipowicz et al. (2008). Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nature Reviews Genetics 9, 102-114.
Flynt and Lai (2008). Biological principles of microRNA-mediated regulation: shared themes amid diversity. Nature Reviews Genetics 9, 831-842.
Aravin et al. (2007). The Piwi-piRNA Pathways Provides an Adaptive Defence in the Transposon Arms Race. Science 318, 761-764.
Grewal and Elgin (2007). Transcription and RNA interference in the formation of heterochromatin. Nature 447, 399-406.
Hershko A, Ciechanover A, Varshavsky A. Basic Medical Research Award. The ubiquitin system. Nat Med. 2000 Oct;6(10):1073-81.

Weissman AM. Themes and variations on ubiquitylation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001 Mar;2(3):169-78. Review.

Pickart CM, Cohen RE. Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat Rev Mol Cell Biol. 2004 Mar;5(3):177-87. Review.

Winget JM, Mayor T. The diversity of ubiquitin recognition: hot spots and varied specificity. Mol Cell. 2010 Jun 11;38(5):627-35. Review.

Hicke L. Protein regulation by monoubiquitin. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001 Mar;2(3):195-201. Review.

Geiss-Friedlander R, Melchior F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Dec;8(12):947-56. Review.

Metodi didattici

Al corso sono assegnati 9 cfu complessivi. 7 cfu, equivalenti a 56 ore, saranno utilizzati per lezioni frontali in aula sull'analisi e discussione degli articoli scientifici e su altro materiale integrativo. 2 cfu, equivalenti a 30 ore, saranno dedicati, nel mese di Gennaio 2019, ad attivita' sperimentale in laboratorio.

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

Il voto finale del corso viene assegnato a ciascuno studente sulla base di: una prova scritta individuale, sulla valutazione dell'attività e della relazione del laboratorio, e sulla consegna di alcuni "esercizi" proposti agli studenti durante le lezioni frontali. La prova scritta è composta di 6 gruppi di domande riguardanti 6 degli argomenti (articoli scientifici) affrontati a lezione. Il sostenimento della prova scritta e' subordinata alla partecipazione a tutte le attivita' di laboratorio.

La prova scritta mira a valutare il raggiungimento dei seguenti obiettivi didattici:

1) Riconoscere e descrivere le procedure sperimentali degli articoli scientifici discussi.

2) Conoscere e interpretare i risultati sperimentali.

3) Conoscere le problematiche bio-molecolari nelle quali i risultati si collocano.

Il sostenimento della prova scritta e' subordinata alla partecipazione a tutte le attivita' di laboratorio e alla compilazione di una breve relazione scritta.

Strumenti a supporto della didattica

Articoli scientifici originali.

Copia delle Presentazioni PowerPoint utilizzate in aula
Laboratorio didattico di Biologia Molecolare.

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Davide Carlo Ambrosetti