Abstract
Validazione di sistemi di coltura 3D primari da tumori spontanei del cane come modelli in vitro per lo studio del fenotipo, genotipo e metabolismo tumorale. Il progetto ha l’obiettivo di generare colture cellulari 3D derivate da tumori spontanei del cane, per dimostrarne la fattibilità e le somiglianze tra il tumore primario e la corrispondente coltura 3D. Sono stati scelti i seguenti istotipi di neoplasie del cane: emangiosarcomi, osteosarcomi, melanoma e carcinoma uroteliale. Le indagini sulle somiglianze tra il tumore primario e la controparte coltivata in 3D prenderanno in considerazione i seguenti aspetti: 1. Espressione degli stessi marcatori di differenziazione da parte delle cellule neoplastiche nel tumore primario e nel corrispondente sistema 3D valutati mediante metodica immunoistochimica con CD31 e FVIII-RA per gli emangiosarcomi, vimentina e fosfatasi alcalina per gli osteosarcomi, Melan-A, S100 e PNL2 per i melanomi, pancitocheratina e uroplachina per i carcinomi uroteliali. 2. Espressione delle stesse alterazioni genetiche tra tumore primario e sistema 3D che, integrate con i dati del punto 1, aumentano le evidenze della replicazione, nel sistema 3D, delle stesse cellule neoplastiche primarie; mediante NGS saranno indagati i seguenti geni: BRAF, CDKN2A, CDKN2B, DMD, KRAS, MYC, NRAS, PIK3CA, PLCG1, PTEN, RB1, SETD2, TP53. 3. Identificazione del passaggio metabolico delle cellule tumorali nelle colture 3D da metabolismo ossidativo a glicolitico. Il raggiungimento degli obiettivi sopra indicati permetterà una validazione preliminare delle colture 3D come modelli in vitro in grado di replicare adeguatamente la crescita e le condizioni metaboliche del tumore primario.
Risultati raggiunti
Il principale risultato raggiunto è stato la generazione di colture primarie tridimensionali (3D) e la loro gestione come campioni tissutali per indagini istologiche, biochimiche e genomiche. Sono stati impiegati n.10 emangiosarcomi; n. 5 osteosarcomi; n. 2 carcinomi uroteliali e n. 6 melanomi orali. La maggior parte del lavoro è stata dedicata all'ottimizzazione delle condizioni di crescita, confrontando l'impiego di un bioreattore (VITVO®, Rigenerand) con un sistema di coltura su piastra che utilizzava lo stesso scaffold impiegato nel dispositivo VITVO®. Entrambi i metodi di coltura hanno prodotto crescite 3D con una cellularità comparabile; tuttavia, il sistema su piastra ha richiesto un numero inferiore di cellule per la semina, rappresentando una condizione più favorevole quando le cellule derivano da biopsie. Il confronto tra tumori primari e le corrispondenti crescite 3D in termini di espressione dei marcatori immunoistochimici, attività del metabolismo ossidativo mitocondriale e analisi NGS ha prodotto i seguenti risultati. 1) Otto emangiosarcomi su dieci, tutti e due i carcinomi uroteliali e 5 melanomi orali su 6 hanno mostrato nelle colture 3D un'espressione dei marcatori sovrapponibile a quella dei rispettivi tumori primari. Al contrario, la bassa cellularità delle colture è risultata il principale fattore limitante del confronto ed è stata osservata soprattutto negli osteosarcomi, che hanno evidenziato una ridotta capacità di crescita in vitro. 2) L'analisi del metabolismo ossidativo ha evidenziato che, nei mitocondri isolati sia dai tessuti freschi sia dalle colture 3D, non sono state osservate variazioni unidirezionali costanti nelle attività dei complessi respiratori I (CI), II (CII) e IV (CIV); tuttavia, è emerso un rimodellamento specifico che interessa selettivamente i singoli complessi della catena respiratoria. Il confronto dell'attività del complesso IV (CIV) tra tumori primari e colture 3D è risultato più costane nel denotare un aumento nelle colture 3D rispetto ai tumori primari. 3) Sei emangiosarcomi su dieci (2 casi WT, 1 caso ognuno mutazione SETD2, DMD, TP53, BRAF-NRAS), 2 carcinomi uroteliali su 2 (un caso WT e 1 caso mutazione BRAF), 2 osteosarcomi su 5 (un caso mutazione TP53 ed 1 caso mutazione TP53+SETD2) e 4 melanomi orali su 6 (tutti WT) hanno mostrato una completa concordanza con i rispettivi tumori primari all'analisi NGS. Anche in questo confronto, la bassa cellularità delle colture ha rappresentato il principale fattore limitante dei risultati. Nel complesso, la generazione di colture con un'adeguata cellularità si è dimostrata un prerequisito fondamentale per ottenere modelli in vitro capaci di riprodurre fedelmente il panorama fenotipico e genotipico dei tumori primari; tuttavia, è necessario tenere conto delle differenze nelle condizioni metaboliche, probabilmente correlate alla diversa disponibilità di ossigeno negli ambienti in vitro rispetto a quelli in vivo.Project details
Unibo Team Leader: Giuseppe Sarli
Unibo involved Department/s:
Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie
Coordinator:
ALMA MATER STUDIORUM - Università di Bologna(Italy)
Total Eu Contribution: Euro (EUR) 207.074,00
Total Unibo Contribution: Euro (EUR) 100.074,00
Project Duration in months: 24
Start Date:
12/10/2023
End Date:
28/02/2026
