Abstract
La CANVAS (Cerebellar Ataxia, Neuropathy, Vestibular Areflexia Syndrome) è una malattia neurodegenerativa che si manifesta in età adulta, a decorso progressivo e fortemente invalidante, caratterizzata da atassia cerebellare, neuropatia e areflessia vestibolare. Nella maggior parte dei casi, la sindrome CANVAS è causata da espansioni genetiche in entrambe le copie del gene RFC1, che codifica per una proteina essenziale per la replicazione del DNA e coinvolta anche nella riparazione delle rotture a singolo filamento del DNA. Ad oggi, non esistono trattamenti disponibili per questa patologia, poiché la sua patogenesi non è ancora del tutto chiara. È importante sottolineare che la CANVAS, detta anche atassia-RFC1 quando non si manifestano tutte e tre i principali aspetti neurologici, non solo rappresenta una delle cause genetiche più comuni di atassia ereditaria ad esordio in età adulta, ma il suo spettro comprende anche aspetti patologici che mimano disturbi neurodegenerativi ad esordio tardivo più comuni, come il morbo di Parkinson. Per questo motivo, comprendere in modo più approfondito i meccanismi alla base della malattia non è solo essenziale per sviluppare terapie mirate in grado di rallentarne o bloccarne la progressione, ma potrebbe anche fornire informazioni utili per affrontare altre patologie neurodegenerative ad esordio tardivo. Ad oggi, poiché lo spettro della atassia- RFC1 è di recente definizione e tuttora in fase di studio, non è ancora stato chiarito il meccanismo patogenetico, ossia le basi molecolari dell’insorgenza e/o progressione della malattia, non sono disponibili dati prospettici sulla storia naturale della malattia e mancano biomarcatori specifici e validati della malattia, utili sia per la diagnosi sia per il monitoraggio della progressione della malattia e della risposta ad eventuali trattamenti. Nell’ambito del progetto PRIN 2022 (PI Dott.ssa Gabriella Silvestri), che ha visto la collaborazione di neurologi dell’Università Cattolica del Sacro Cuore di Roma e dell’Unità di ricerca di biochimica dell’Università di Bologna coordinata dalla Prof.ssa Alessandra Baracca, è stato sviluppato uno studio prospettico con tre obiettivi: 1) raccogliere dati clinici e diagnostici, che valutino tutte le principali caratteristiche della malattia al fine di definirne la storia naturale e verificare se esista una scala clinica più sensibile alla progressione della patologia, da utilizzare in futuri studi clinici; 2) far luce sui meccanismi patogenetici della malattia; e 3) testare nel plasma la sensibilità di biomarcatori di neurodegenerazione e di stress ossidativo da utilizzarsi quali indicatori diagnostici e prognostici della atassia-RFC1.
Risultati raggiunti
L’Unità di Roma, coordinata dalla Dott.ssa Silvestri, ha arruolato 24 pazienti provenienti da 23 famiglie con diagnosi molecolare di atassia-RFC1 e 18 controlli sani. È stata quindi condotta una valutazione clinica completa dei pazienti, includendo la raccolta dei principali dati demografici e relativi alla patologia ed un’analisi neurologica completa. I dati sono in fase di analisi statistica, al fine di verificare quale scala sia più sensibile ai cambiamenti del fenotipo clinico avvenuto nel periodo di tempo intercorso tra due momenti di valutazione clinica dei pazienti. Inoltre, l’unità di Roma ha analizzato e sta completando lo studio di marcatori di stress ossidativo e di neurodegerazione in campioni di sangue raccolti da pazienti e da soggetti sani. In diverse patologie neurodegenerative che si manifestano con un fenotipo clinico simile alla malattia da RFC-1, quali ad esempio l’atassia ereditaria di Friedreich e l’atassia associata a POLG1, la disfunzione mitocondriale e lo stress ossidativo rivestono un ruolo cruciale nella insorgenza e/o progressione della malattia. Pertanto, uno dei principali obbiettivi dello studio è stato quello di valutare il contributo della funzionalità mitocondriale e dello stress ossidativo alla patogenesi della CANVAS. Per questo motivo, l’Unità di Bologna, coordinata dalla Prof.ssa Baracca, ha svolto un’analisi approfondita della funzionalità mitocondriale su fibroblasti isolati da biopsie cutanee di 6 pazienti e 6 controlli sani di pari età, effettuando studi sulla morfologia, dinamica e bioenergetica mitocondriale, ossia capacità di produrre energia (ATP) attraverso la fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Il team di ricerca ha studiato l'organizzazione e la morfologia della network mitocondriale dei fibroblasti mediante microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione. L'analisi quantitativa, utilizzando dei software dedicati, ha evidenziato come tutti i parametri morfologici esaminati mediante microscopia a fluorescenza siano significativamente alterati nei fibroblasti derivati dai pazienti rispetto ai controlli. I risultati conseguiti sono stati confermati anche dalle analisi di microscopia elettronica a trasmissione, che ha evidenziato come i mitocondri dei fibroblasti dei pazienti CANVAS siano di dimensioni più piccole e presentino una morfologia meno allungata e ramificata rispetto ai controlli. Nel complesso, questi risultati indicano chiaramente che il network mitocondriale nei fibroblasti dei pazienti è più frammentato rispetto a quello dei controlli. Considerando che un network mitocondriale frammentato è solitamente associato a disfunzione mitocondriale, abbiamo indagato in modo approfondito la bioenergetica mitocondriale, con particolare attenzione alla funzionalità della catena respiratoria e dell’ATP sintasi. A tal fine, in presenza di substrati energetici e dell’ATP sintasi (ADP) saturanti, è stata misurata la velocità massima di consumo di ossigeno e, inaspettatamente, i valori medi della velocità di respirazione dei fibroblasti dei pazienti CANVAS sono risultati significativamente più elevati rispetto ai controlli (+30%). In accordo con quanto osservato, l’analisi diretta della velocità di sintesi di ATP ha dimostrato inequivocabilmente che la velocità della fosforilazione ossidativa nelle cellule dei pazienti è maggiore rispetto ai controlli (+25%). Questi risultati sono stati confermati anche dalle analisi condotte su cellule intatte e senza alcuna perturbazione del sistema cellulare. Queste indagini dimostrano che nei pazienti CANVAS non vi è alcuna compromissione della bioenergetica mitocondriale e che, al contrario, il contributo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS) alla produzione dell’energia necessaria per soddisfare il fabbisogno energetico cellulare è maggiore nei pazienti affetti da CANVAS rispetto ai controlli sani. Per comprendere le ragioni molecolari di quanto osservato, è stata analizzata la quantità di mitocondri contenuti nelle cellule dei pazienti e dei controlli, ossia la massa mitocondriale, come pure i livelli dei complessi proteici che partecipano al processo della fosforilazione ossidativa ed abbiamo dimostrato che, nei pazienti CANVAS, l’incremento della massa mitocondriale è responsabile dell’ incremento della velocità della fosforilazione ossidativa ossia della produzione di energia (ATP).. Essendo il mitocondrio la sede primaria dell’utilizzo dell’ossigeno, che è sia l’accettore finale degli elettroni della catena respiratoria sia il precursore dell’anione superossido, l'aumento della velocità della respirazione mitocondriale nei fibroblasti dei pazienti ci ha indotto ad indagare lo stress ossidativo, in particolare la produzione ed i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Sia i livelli del radicale anione superossido mitocondriale che dei ROS totali sono risultati incrementati di circa il 100% nei fibroblasti dei pazienti rispetto ai controlli. Conseguentemente, sono stati indagati anche i principali sistemi di difesa antiossidante della cellula. I livelli intracellulari di glutatione ridotto, una delle molecole più importanti nel contrastare lo stress ossidativo, ed i livelli intracellulari di enzimi quali la Mn-SOD e la catalasi, sono risultati significativamente ridotti nei fibroblasti dei pazienti. Infine, è stato dimostrato che le cellule dei pazienti hanno una maggior tendenza ad andare incontro a morte cellulare apoptotica mitocondrio-dipendente. Questi risultati suggeriscono come l’aumenta attività mitocondriale nei fibroblasti dei pazienti sia associata ad uno squilibrio redox e ad un potenziale incremento dello stress ossidativo, che potenzialmente potrebbe essere ancora più grave in cellule con un elevato metabolismo energetico mitocondrio dipendente, quali i neuroni. Nel complesso, questo studio esclude che la disfunzione mitocondriale sia responsabile o contribuisca alla patogenesi della CANVAS, ma al contempo evidenzia come lo stress ossidativo possa avere un ruolo centrale nell’insorgenza e/o progressione della patologia. I risultati scientifici ottenuti saranno oggetto di diverse pubblicazioni su riviste internazionali. Un primo articolo, che sta per essere sottomesso per pubblicazione, è incentrato sui risultati conseguiti dallo studio della funzionalità mitocondriale nei fibroblasti dei pazienti CANVAS. Un secondo articolo, in preparazione, è focalizzato sul ruolo dello stress ossidativo nella patogenesi della mattia, ed integra i risultati ottenuti nei fibroblasti con quelli derivati da analisi di biomarcatori nei campioni di sangue dei pazienti, al fine di validarli come strumenti diagnostici e prognostici per la malattia.Project details
Unibo Team Leader: Alessandra Baracca
Unibo involved Department/s:
Dipartimento di Scienze Biomediche e Neuromotorie
Coordinator:
Università Cattolica del Sacro Cuore(Italy)
Total Unibo Contribution: Euro (EUR) 99.280,00
Project Duration in months: 24
Start Date:
18/10/2023
End Date:
28/02/2026
