Abstract
La sintesi proteica mitocondriale richiede diverse proteine strutturali e regolatrici codificate dal DNA nucleare e traslocate nei mitocondri dopo la traduzione nel citoplasma. Tra queste, le aminoacil-tRNA sintetasi mitocondriali (mt-AARS) sono un gruppo di enzimi responsabili della catalisi delle reazioni di esterificazione che legano gli amminoacidi ai tRNA coniugati, garantendo la corretta associazione codone-anticodone determinata dal codice genetico. Varianti recessive sono state trovate in tutti i geni mt-AARs e associate a malattie mitocondriali a esordio precoce che progrediscono verso una grave disabilità e morte prematura. Ad eccezione del difetto di DARS2, non sono disponibili modelli di malattia e gli studi sono limitati alla caratterizzazione delle linee cellulari dei fibroblasti dei pazienti. Pertanto, rimangono aperte diverse questioni sul meccanismo della malattia e non sono disponibili trattamenti curativi per questi disturbi severi ed invalidanti. La nostra proposta di ricerca si concentra sulle varianti recessive del gene RARS2 (che codifica per l’arginina-tRNA sintetasi) che causano l'ipoplasia pontocerebellare di tipo 6, definita dalla triade atrofia pontocerebellare con o senza atrofia corticale cerebrale, ipotonia e aumento del lattato nel sangue e nel liquido cerebrospinale. Un'analisi retrospettiva dei risultati clinici e neuroradiologici ha dimostrato una correlazione tra il tasso di sopravvivenza e la gravità e la complessità dei pattern di imaging cerebrale. Studi neuropatologici post mortem suggeriscono che la progressione dell'encefalopatia potrebbe essere dovuta sia a un deterioramento dello sviluppo neurologico che a processi neurodegenerativi. La nostra ipotesi centrale è che RARS2 abbia un ruolo sia nel differenziamento precoce delle cellule staminali pluripotenti verso le cellule di microglia e le linee neurali, sia nel mantenimento delle cellule staminali neurali e dei neuroni maturi. La gravità della patologia potrebbe quindi dipendere dalla profondità e dalla tempestività con cui questi meccanismi sono influenzati dai difetti di RARS2. Per dimostrare la nostra ipotesi, genereremo per la prima volta cellule staminali pluripotenti e le differenzieremo in linee neurali e microgliali. Nei nostri istituti di ricerca è già disponibile una biobanca di linee cellulari di fibroblasti di sei pazienti portatori di varianti patogene in RARS2. Ai nostri modelli di malattia verrà applicata un'analisi combinata biochimica, genetica molecolare e di trascrittomica spaziale a singola cellula per consentire l'identificazione dei fattori chiave responsabili della specificità tissutale dei disturbi (Obiettivo 1). Per sviluppare terapie sperimentali, ci concentreremo sui difetti del gene RARS2 con un approccio su due fronti: a. tecnologia CRISPR/Cas9 di editing primario con una libreria di RNA guida per modificare le varianti genetiche; b. screening di riposizionamento di farmaci con composti approvati dalla FDA (Obiettivo 2). Il primo approccio consentirà di elaborare una prova di principio per la terapia genica, mentre il secondo approccio ha il potenziale di identificare una terapia che può essere immediatamente tradotta in uso umano. I risultati del nostro progetto consentiranno di comprendere il meccanismo della malattia da difetto di RARS2 e di sviluppare strategie terapeutiche che potrebbero avere un impatto su altri difetti mt-AARS.
Risultati raggiunti
L’obiettivo era quello di studiare la vulnerabilità specifica dei tessuti e i meccanismi patogenetici nella PCH6 correlata al gene RARS2, nonché di identificare potenziali bersagli terapeutici. Sono state analizzate linee cellulari di fibroblasti provenienti da quattro famiglie non imparentate e portatrici di varianti patogene del gene RARS2. I fibroblasti hanno mostrato una firma patogenetica distintiva. L’analisi trascrittomica ha rivelato un panorama di espressione alterato, caratterizzato da un arricchimento delle vie dello stress ossidativo e dell’infiammazione. Gli studi biochimici hanno evidenziato alterazioni in molteplici processi legati ai mitocondri: riduzione della traduzione citosolica/mitocondriale; livelli anomali allo stato stazionario dei complessi OXPHOS; disregolazione della dinamica mitocondriale e anomalie nei marcatori dell’autofagia/mitofagia. L’attivazione della risposta integrata allo stress e dei geni stimolati dall’interferone ha ulteriormente avvalorato la presenza di uno stato infiammatorio probabilmente indotto da uno stress mitocondriale cronico. Questo fenotipo patogeno è stato parzialmente attenuato dalla supplementazione con L-arginina, suggerendo una potenziale via terapeutica. Per esplorare la specificità tissutale, i fibroblasti sono stati riprogrammati in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e differenziati in cellule staminali neurali, che hanno mostrato analogamente una ridotta traduzione citosolica, indicando un meccanismo patologico secondario conservato. Conclusioni: Questi risultati evidenziano come diverse vie mitocondriali, non solo quelle direttamente coinvolte nelle funzioni di RARS2, contribuiscano alla patogenesi della PCH6, fornendo approfondimenti meccanicistici ed evidenziando potenziali bersagli per terapie sperimentali.Project details
Unibo Team Leader: Caterina Garone
Unibo involved Department/s:
Dipartimento di Scienze Mediche e Chirurgiche
Coordinator:
ALMA MATER STUDIORUM - Università di Bologna(Italy)
Total Eu Contribution: Euro (EUR) 187.522,00
Total Unibo Contribution: Euro (EUR) 100.000,00
Project Duration in months: 24
Start Date:
28/09/2023
End Date:
28/02/2026
