00062 - BIOCHIMICA APPLICATA

Conoscenze e abilità da conseguire

Al termine del corso lo studente: - acquisisce le conoscenze di base delle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi di biomolecole allo scopo di conoscere e comprendere l’organizzazione e la funzione degli organismi viventi a livello molecolare - è in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica. I 2 CFU di laboratorio permetteranno allo studente di acquisire competenze pratiche di alcune metodologie applicate nella sperimentazione biochimica e biochimica clinica con particolare attenzione per la logica dell'impostazione degli esperimenti e della raccolta dati.

Contenuti

Modulo1 di Biochimica Applicata- (3 CFU) - Prof.ssa Cecilia Prata

Introduzione - Principii della ricerca biochimica. Sperimentazione biochimica.

Cenni di Microscopia

1. Tecniche preparative

Colture cellulari: strumentazione di base di un laboratorio di colture cellulari (cappe a flusso laminare, incubatori). Colture cellulari primarie e linee cellulari. Terreni di coltura e tecniche di coltura.

Fluidi biologici e Anticorpi: Sangue, Plasma, Siero, Urine e altri fluidi biologici. Struttura degli anticorpi, reazione antigene-anticorpo. Produzione di antisieri, anticorpi monoclonali. Metodi per dosare anticorpi (es. Test sierologici) e anticorpi per dosare antigeni (es. Test gravidanza) cenni a tecniche immuno enzimatiche (ELISA).

Preparazione di campioni da tessuti biologici: Scelta del tampone. Omogeneizzazione (scelta delle metodiche e dei media).

Tecniche centrifugative (principii della sedimentazione; velocità, RCF, coefficiente di sedimentazione e tempi di sedimentazione). Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari; flottazione differenziale di lipoproteine. Centrifugazione in gradiente di densità, zonale e isopicnica. Applicazioni: separazione di cellule, organelli subcellulari, proteine, acidi nucleici. Valutazione della resa e dell'arricchimento: “marcatori” subcellulari.

Metodiche di purificazione delle proteine: precipitazione frazionata di proteine con solfato d'ammonio e isoelettrica; precipitazione con solventi e polimeri organici; precipitazione al calore. Dialisi ed ultrafiltrazione: principii ed applicazioni.

2. Tecniche elettroforetiche

Principii generali, fattori che influenzano la mobilità elettroforetica

Elettroforesi su gel: PAGE, PAGE-SDS. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.

Focalizzazione isoelettrica (IEF). Elettroforesi bidimensionale. Metodi di rivelazione e valutazioni quantitative.

Blotting - Western blotting nello studio delle proteine: applicazioni biochimiche e diagnostiche.

3. Tecniche cromatografiche

Principii generali, risoluzione e piatti teorici. Cromatografia su colonna.

Cromatografia idrofobica di proteine (HIC).

 

Modulo 2 di Biochimica Applicata -(3 CFU)- Prof.ssa Romana Fato

1. Cromatografia liquida ad alta pressione:HPLC.

principali componenti di un sistema HPLC; scelta delle fasi stazionaria e mobile in funzione dell'analisi da eseguire

principali detectors associati ad un sistema HPLC.

2. Metodi di purificazione di enzimi.

scelta della tecnica di purificazione più adatta al campione in esame.

determinazione dell'attività specifica e valutazione della resa.

3. Dosaggi enzimatici.

richiami di cinetica enzimatica, ipotesi dello stato stazionario ed equazione di Michaelis-Menten.

Determinazione sperimentale della velocità delle reazioni catalizzate da enzimi: Dosaggio dell'attività enzimatica: metodi continui, discontinui, diretti, indiretti e accoppiati.

studio dell'inibizione enzimatica: inibitori competitivi, non competitivi e misti. Grafico di Lineweaver-Burk , determinazione della Ki.

Enzimi immobilizzati.

4. Tecniche di spettroscopia UV-Vis

richiami di spettroscopia UV-Vis, legge di Lambert Beer, strumentazione, cromofori.

dosaggi colorimetrici.

metodi per la determinazione del contenuto proteico di un campione biologico.

5. Tecniche spettrofluorimetriche.

richiami di spettrofluorimetria, resa quantica, decadimento di fluorescenza, strumentazione, cromofori intrinseci ed estrinseci. strumentazione.

Uso delle tecniche fluorimetriche nell'analisi qualitativa e quantitativa (linearità della relazione tra l'intensità di fluorescenza e la concentrazione della soluzione, effetto di filtro interno).

Fosforescenza e chemiluminescenza: principi di base ed applicazioni pratiche.

applicazioni biologiche delle tecniche fluorimetriche: localizzazione di fluorofori e studio di dinamiche di interazione molecolare sfruttando il fenomeno del quenching di fluorescenza (collisionale o dinamico e statico) costante di Stern-Volmer e determinazione del coefficiente di diffusione di un fluoroforo in soluzione.

trasferimento di energia per risonanza (FRET) : efficienza del trasferimento di energia, esempi di applicazione : studi di oligomerizzazione delle proteine, interazione proteina-acidi nucleici e proteina lipidi.

Fluorescenza in luce polarizzata: determinazione di anisotropia statica e dinamica: principi di base ed applicazioni allo studio delle proteine

6. tecniche di spettrocopia di assorbimento in luce polarizzata.

Dicroismo circolare: principi di base ed applicazioni per lo studio della struttura della proteine (determinazione del contenuto di alfa elica e foglietto beta). Principi di base del light-scattering e suo utilizzo per lo studio delle dimensioni di particelle (citofluorimetro).

7. applicazioni della spettrometria di massa allo studio di macromolecole biologiche.

Principi di base della spettroscopia di Massa: sorgente di ioni (Maldi, ESI), analizzatore di massa (TOF, analizzatore a quadrupolo).

Esempi di applicazione della massa per lo studio/identificazione di un polipeptide. Peptide mass fingerprinting.

Uso della spettroscopia di massa per la determinazione delle modificazioni indotte sulle proteine: grado di fosforilazione, alchilazione/acetilazione di residui aminoacidici, studio dell'interazione con farmaci ecc.

Determinazione della sequenza di proteine (sequenziamento di Edman e mediante spettrometria di massa).

8. Tecniche elettrochimiche.

Elettrodo ad ossigeno; studi sulla respirazione mitocondriale. Biosensori.

9. Tecniche di biologia molecolare.

Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali.

Reazione a Catena della Polimerasi (PCR): principi e applicazioni diagnostiche, forensiche e paleobiologiche.

Sequenze VNTR: test di paternità. Identificazione di specifiche sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione di Southern (Southern blotting) e applicazioni nella diagnosi di malattie genetiche.

Northern blotting e applicazioni nello studio dell'espressione genica.

Valutazione dell'espressione genica: la tecnica del DNA microarray.

12. Cenni sulle applicazioni della proteomica.

 

 

Modulo 3 di Biochimica Applicata (2CFU) Prof.ssa Anna Maria Ghelli

PROGRAMMA DEL MODULO DI LABORATORIO DI BIOCHIMICA APPLICATA

Al termine del laboratorio didattico di Biochimica Applicata, lo studente avrà applicato alcune tecniche biochimiche per lo studio delle proteine e acquisito le conoscenze sui principi su cui si basano.

Il laboratorio sarà strutturato in sei esercitazioni differenti, alcune interconnesse fra di loro, associate ad alcune ore di spiegazione dei principi delle tecniche che saranno utilizzate durante le esperienze.

• DOSAGGIO COLORIMETRICO DELLE PROTEINE CON IL METODO DI BRADFORD

  Lo scopo di questo laboratorio è la determinazione della concentrazione proteica di una miscela di proteine (Lattico deidrogenasi, LDH e citocromo c, CYTC) utilizzando il metodo colorimetrico di Bradford. Il risultato ottenuto verrà utilizzato per determinare il volume di miscela proteica da caricare sulla colonna cromatografica in modo da separare una quantità nota di miscela proteica.

  Tecniche utilizzate: Spettroscopia UV-VIS

• SEPARAZIONE DI PROTEINE MEDIANTE CROMATOGRAFIA A SCAMBIO IONICO

  Lo scopo di questo laboratorio è la separazione delle due proteine dalla miscela proteica di cui è stata determinata la concentrazione nell’esperienza precedente tramite una colonna cromatografica a scambio ionico, sfruttando il loro diverso punto isoelettrico. Le frazioni cromatografiche delle due proteine separate verranno utilizzate nelle esperienze successive per determinare il loro grado di purezza e il loro peso molecolare tramite elettroforesi su gel di acrilamide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE) e per determinare alcuni parametri cinetici della lattico deidrogenasi.

  Tecniche utilizzate: Cromatografia a scambio ionico, Spettroscopia UV-VIS

• SEPARAZIONE DI PROTEINE MEDIANTE GEL-ELETTROFORESI (SDS-PAGE)

  Lo scopo di questo laboratorio è quello verificare l'avvenuta purificazione delle proteine separate tramite cromatografia a scambio ionico e di determinare il loro peso molecolare attraverso una elettroforesi su gel di poliacrilamide (SDS-PAGE).

  Tecniche utilizzate: Elettroforesi su gel

• DETERMINAZIONE DELLA Km e Vmax DELLA LATTICO DEIDROGENASI PER IL PIRUVATO E IL NADH

  Lo scopo di questo laboratorio è di determinare alcuni parametri cinetici dell’enzima Lattico Deidrogenasi che è stato precedentemente purificato tramite cromatografia a scambio ionico dalla miscela proteica. Verranno misurate le velocità di reazione a diverse concentrazioni dei due substrati utilizzando un saggio enzimatico diretto.

  Tecniche utilizzate: Spettroscopia UV-VIS

• DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’ DELLA LATTICO DEIDROGENASI RILASCIATA NEL TERRENO DI COLTURA CELLULARE

  Lo scopo di questo laboratorio è di misurare il rilascio dell’enzima lattico deidrogenasi nel terreno di coltura in cellule trattate con sostanze citotossiche. La presenza dell’enzima nel terreno di coltura è indice di morte di tipo necrotico mentre la sua assenza è indice di morte di tipo apoptotico.

  Tecniche utilizzate: Spettroscopia UV-VIS

• SAGGIO DI DETERMINAZIONE DELLA VITALITA’ CELLULARE

Lo scopo di questo laboratorio è determinare il numero di cellule vitali dopo trattamento con induttori di morte apoptotica e necrotica. Verrà utilizzato il saggio di vitalità cellulare che utilizza sulforodamina B (SRB).

Tecniche utilizzate: lettura dell’assorbanza dell’SRB al lettore di piastre

 

 

Testi/Bibliografia

K.Wilson e J.Walker - Biochimica e Biologia Molecolare: Principi e tecniche - Cortina Editore, 2006

K.Wilson e J.Walker - Biochimica e Biologia Molecolare: Principi e tecniche – NUOVA EDIZIONE (VIII) 2019

M.Maccarrone - Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli 2019

Metodi didattici

L'insegnamento prevede 6 crediti frontali e 2 crediti di laboratorio, in cui verranno prese in considerazione una serie di tecniche biochimiche e la loro applicazione nella ricerca biomedica.

Durante le lezioni frontali verranno presentate le metodiche connesse con la sperimentazione biochimica negli aspetti sia strumentali sia applicativi. Per ogni tecnica verranno discussi esempi pratici.

Nei crediti di laboratorio cui verranno affrontati dal punto di vista pratico problemi come: la determinazione del contenuto proteico di una soluzione, la determinazione di parametri cinetici enzimatici, saggi di vitalità cellulare

 

“In considerazione delle tipologie di attività e metodi didattici adottati, la frequenza di questa attività formativa richiede lo svolgimento di tutti gli studenti dei Moduli 1 e 2 in modalità e-learning [https://www.unibo.it/it/servizi-e-opportunita/salute-e-assistenza/salute-e-sicurezza/sicurezza-e-salute-nei-luoghi-di-studio-e-tirocinio] e la partecipazione al Modulo 3 di formazione specifica sulla sicurezza e salute nei luoghi di studio. Indicazioni su date e modalità di frequenza del Modulo 3 sono consultabili nella apposita sezione del sito web di corso di studio.”

Modalità di verifica e valutazione dell'apprendimento

Per i moduli 1 e 2 l’esame consiste in un colloquio orale su entrambi i moduli didattici, che non possono essere sostenuti in momenti di verifica separati fra loro.

L'esame di fine corso mira a verificare e valutare il raggiungimento degli obiettivi didattici:

- conoscere i principi di base delle principali metodologie biochimiche utilizzate nella separazione, identificazione, caratterizzazione ed analisi di biomolecole;

- essere in grado di disegnare o di valutare protocolli sperimentali impiegati nella ricerca biochimica.

La durata della prova orale è mediamente di 30-45 minuti.

Per il modulo 3 (laboratorio) l’esame consisterà in un test con 10 domande sull’esperienze fatte in laboratorio. Il test durerà circa 30 minuti.

Il voto finale del Corso di Biochimica Applicata (Moduli I, II e III) sarà definito dalla media pesata tra il voto del modulo di laboratorio e quello della prova orale articolata su tre principali quesiti che verteranno su argomenti inerenti gli obiettivi del Corso. La valutazione della preparazione del candidato potrà avvalersi di ulteriori domande volte a specificare aspetti relativi ai tre quesiti principali.

Sarà oggetto di valutazione la capacità dello studente di sapersi muovere all'interno delle varie tecniche e applicazioni biochimiche. Il raggiungimento da parte dello studente di una visione organica dei temi affrontati a lezione congiunta alla loro utilizzazione critica, la dimostrazione del possesso di una padronanza espressiva e di linguaggio specifico saranno valutati con voti di eccellenza.

Strumenti a supporto della didattica

Videoproiettore, PC, Lavagna luminosa

Orario di ricevimento

Consulta il sito web di Romana Fato

Consulta il sito web di Cecilia Prata

Consulta il sito web di Anna Maria Ghelli